以細(xì)菌群體感應(yīng)為靶標(biāo)的抑制因子篩選.pdf

1、隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性已成為全球關(guān)注的重大難題。目前臨床上使用的抗生素都是通過(guò)直接殺死微生物或抑制微生物生長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)抗感染的目的，在這種生存壓力下，細(xì)菌很容易產(chǎn)生耐藥性。顯然以傳統(tǒng)的靶點(diǎn)和篩選方法獲得的抗生素?zé)o法從根本上解決細(xì)菌的耐藥問(wèn)題，因此，尋找治療細(xì)菌感染的新途徑已成為當(dāng)今研究的前沿和熱點(diǎn)。近年來(lái)，細(xì)菌群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)研究的發(fā)展，給我們帶來(lái)了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。研究表明缺失了群體感應(yīng)系統(tǒng)的菌株

2、其致病能力大大降低，因此篩選高效的群體感應(yīng)抑制劑有望成為解決細(xì)菌耐藥問(wèn)題一個(gè)有效途徑。以細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶標(biāo)篩得的抗菌藥物，與傳統(tǒng)的抗生素的作用機(jī)制完全不同，只抑制細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)控的致病行為，不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此，理論上細(xì)菌不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。本文以銅綠假單胞菌的las群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶標(biāo)，建立篩選模型，從化合物庫(kù)和海洋微生物中篩選群體感應(yīng)抑制因子(quorum sensing inhibitor，QSI)。 利用銅綠假單胞菌l

3、as群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的lasB基因啟動(dòng)子，與報(bào)告基因gfp(綠色熒光蛋白基因)或SacB(蔗糖致死基因)，構(gòu)建融合質(zhì)粒pW-1和pW-4，轉(zhuǎn)入群體感應(yīng)系統(tǒng)缺失突變株P(guān)AO-MW1中，建立兩種高靈敏度群體感應(yīng)抑制因子篩選模型PAO-MWlpW-1和PAO-MWlpW-4；模型PAO-MWlpW-1在0.5μM3-O-C12-HSL存在下，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)GFP表達(dá)情況來(lái)篩選QSI；模型PAO-MWlpW-4可用平板法直接可視化篩選，在0

4、.2μM3-O-C12-HSL、0.2μMC4-HSL和6％的蔗糖存在時(shí)細(xì)胞致死，當(dāng)有QSI同時(shí)存在時(shí)細(xì)胞可被補(bǔ)救。為提高模型PAO-MWlpW-4的靈敏性，建立了一種高靈敏度的TTC活菌染色方法，在PAO-MWlpW-4篩選平板中加0.05％(w/v)的TTC，活菌代謝TTC會(huì)產(chǎn)生紅色甲瓚，而死菌不著色。 從膠州灣海泥分離海洋真菌、放線(xiàn)菌，小體積發(fā)酵制備粗提物，用建立的銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制因子篩選模型及已有的紫色桿菌篩選模

5、型進(jìn)行初步篩選，得3株真菌提取物具銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制活性，1株放線(xiàn)菌提取物具紫色桿菌群體感應(yīng)抑制活性，且在有效濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)沒(méi)有影響。經(jīng)16SrDNA初步鑒定該放線(xiàn)菌為Streptomyces屬。進(jìn)一步研究表明，該提取物能夠顯著降低紫色桿菌受群體感應(yīng)調(diào)節(jié)的紫色菌素產(chǎn)量和相關(guān)蛋白酶的表達(dá)量，且呈濃度依賴(lài)性。 利用建立的篩選模型對(duì)已有的化合物庫(kù)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)法尼醇能夠有效抑制銅綠假單胞菌las群體感應(yīng)系統(tǒng)；在PAOlpq

6、sA-突變體中試驗(yàn)表明該抑制作用與PQS系統(tǒng)無(wú)關(guān)；通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分析、回補(bǔ)試驗(yàn)證明法尼醇能夠和3-O-C12-HSL信號(hào)分子競(jìng)爭(zhēng)lasR蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制las系統(tǒng)調(diào)控的lasB、toxA等毒力相關(guān)基因和swarming行為等。通過(guò)對(duì)法尼醇類(lèi)似物活性分析表明法尼醇的疏水長(zhǎng)鏈上雙鍵的立體構(gòu)象和側(cè)鏈甲基是必要的。 綜上所述，本文建立兩個(gè)高效的銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制抑制因子篩選模型；并從海洋微生物提取物中發(fā)現(xiàn)了3株真菌提取物具