一株海洋細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑的分離與活性研究.pdf

1、群體感應(yīng)(Quorum sensing，QS)是指通過細(xì)菌密度來協(xié)調(diào)自身的群體行為，當(dāng)細(xì)菌密度增加時，信號分子（自誘導(dǎo)物）也增加，達到閥值時與胞內(nèi)受體蛋白結(jié)合，從而調(diào)控特定基因的表達。這些特殊基因調(diào)控著細(xì)菌的許多生理功能，如生物發(fā)光、生物膜形成，細(xì)菌的聚集，胞外多糖的產(chǎn)生和毒力因子分泌等。與傳統(tǒng)的抗生素相比，群體感應(yīng)抑制劑(Quorum Sensing Inhibitors，OSI)是在并不影響細(xì)菌生長的情況下，抑制其有害基因的表達，因

2、此不會引起細(xì)菌的耐藥性。
　　本文通過對海洋微生物Raoultella sp.Pan22x的培養(yǎng)基成分和條件優(yōu)化，從而提高粗提物質(zhì)量和群體感應(yīng)抑制活性，并通過分離純化得到單體化合物，并對其進行活性測定來篩選新型群體感應(yīng)抑制劑。同時，對Raoultella sp.Pan22x進行菌種誘變，以便得到高活性菌株。本文主要研究結(jié)果如下:
　　(1)對Raoultella sp.Pan22x發(fā)酵工藝優(yōu)化，以粗提物質(zhì)量和半透明圈直徑為指

3、標(biāo)，通過單因素實驗和正交試驗，從培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件兩方面來確定最佳發(fā)酵工藝，最佳培養(yǎng)基組成:蛋白胨濃度4％，淀粉4％，酵母浸粉0.3％，氯化鈉1％，最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)化條件:接種量10％，溫度30℃，pH7.5，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時間96h，裝液量120mL/250mL，比優(yōu)化前粗提物質(zhì)量提高了75.8％，比優(yōu)化前活性提高了30.2％。
　　(2)對Raoultella sp.Pan22x進行大規(guī)模發(fā)酵，發(fā)酵60L，萃取得到粗

4、提物產(chǎn)量為38.87g。MCI分離制備獲得6個極性部分，洗脫比例體積比為水比甲醇3∶2，2∶3，1∶4以及純甲醇有比較好的活性，最終得到10個化合物。經(jīng)結(jié)構(gòu)解析確定了9個化合物，7個為環(huán)二肽，分別是:為環(huán)（脯氨酸一酪氨酸）(2)，環(huán)（苯丙氨酸-脯氨酸）(3)，環(huán)(4-羥基脯氨酸-苯丙氨酸)(4)，環(huán)（脯氨酸-色氨酸）(6)，環(huán)（脯氨酸-異亮氨酸）(7)，環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）(8)和環(huán)（色氨酸-甘氨酸）(9)，另外兩個分別為吲哚乙醇(1)

5、和色氨酸(5)。對結(jié)構(gòu)鑒定的9個化合物進行群體感應(yīng)抑制活性評價，在不抑制細(xì)菌生長的濃度范圍內(nèi)，9個化合物均能減少CV026紫色菌素的產(chǎn)量;化合物1，4-9可以抑制銅綠假單胞菌PAO1綠膿菌素的產(chǎn)量;化合物1，5和9能抑制生物被膜的產(chǎn)生，猜測結(jié)構(gòu)的變化對群體感應(yīng)抑制活性有一定的影響?；衔?-5、7-9首次從拉烏爾屬中分離得到。
　　(3)對Raoultella sp.Pan22x，通過紫外線，γ射線以及抗生素誘變，對其進行群體感應(yīng)

6、抑制活性測定，通過對紫色桿菌的紫色菌素的產(chǎn)生以及銅綠假單胞菌綠膿菌素、彈性蛋白酶活性和生物被膜的產(chǎn)生等因素的考察，確定Raoultella sp.Pan22x-3，Raoultella sp.Pan22x-5和Raoultella sp.Pan22x-6為正突變菌株，群體感應(yīng)抑制活性強于Pan22x，而Raoultella sp.Pan22x-1,Raoultella sp.Pan22x-2,Raoultella sp.Pan22x-4