一個(gè)新的油菜轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化和血紅蛋白基因SLR2097向甘藍(lán)型油菜中的轉(zhuǎn)化.pdf

1、甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。傳統(tǒng)常規(guī)育種技術(shù)在油菜重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良中起到重要作用，但隨著生產(chǎn)需求對(duì)品種要求的日益提高，常規(guī)育種技術(shù)的局限性也日顯突出。因此采用新技術(shù)將新的基因資源引入油菜十分必要。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化引入外源基因?yàn)橛筒水a(chǎn)量、品質(zhì)、抗性和其它性狀的遺傳改良提供了新途徑，該技術(shù)也是現(xiàn)代生物學(xué)研究中了解特定基因功能與表達(dá)模式不可缺少的手段。但現(xiàn)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜轉(zhuǎn)化方法還存在著轉(zhuǎn)化

2、效率不高、重復(fù)性差、轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)等問(wèn)題，因而限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。因此，建立一個(gè)轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好、轉(zhuǎn)化周期短的油菜轉(zhuǎn)化體系是勢(shì)在必行的。
　　 血紅蛋白(Hemoglobin)普遍存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌、酵母、藻類、原生動(dòng)物等生物體中。血紅蛋白在動(dòng)物體中的生理功能主要是結(jié)合氧并協(xié)助其運(yùn)輸，從而促進(jìn)機(jī)體中氧的供應(yīng)、呼吸鏈電子流量、ATP酶活力等；血紅蛋白在微生物體中可以促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)的合成、代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生等；最近

3、，也有文章報(bào)道血紅蛋白能促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)、提高煙草葉中葉綠素與尼古丁的含量等。
　　 本研究旨在用農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefactiens)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，以甘藍(lán)型油菜品種寧油12號(hào)的子葉節(jié)為外植體，優(yōu)化一個(gè)轉(zhuǎn)化周期短、重復(fù)性好的遺傳轉(zhuǎn)化體系。從而用優(yōu)化了的遺傳轉(zhuǎn)化體系，將血紅蛋白基因(SLR2097)導(dǎo)入油菜中，研究血紅蛋白對(duì)油菜的影響。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下：
　　 ⑴用含有攜帶GFP基因的植物雙元

4、表達(dá)載體pCAMBIA1303的農(nóng)桿菌來(lái)侵染甘藍(lán)型油菜品種寧油12號(hào)的子葉節(jié)外植體，從而優(yōu)化油菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在含有濃度為4 mg/L的6-BA與0.04 mg/L的NAA的篩選培養(yǎng)基中獲得了最高的小芽發(fā)育率為94.38％；而當(dāng)用含有濃度為200μM的乙酰丁香酮與0.02％的silwet L77，OD值為0.8的農(nóng)桿菌懸浮液來(lái)侵染油菜的子葉節(jié)10 min并在含有濃度為200μM的乙酰丁香酮與0.02％的silwet L7

5、7的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)時(shí)，獲得了最高的轉(zhuǎn)化率為6.96％；轉(zhuǎn)基因植株是用PCR技術(shù)、Southem blotting分析來(lái)鑒定的；在熒光顯微鏡下也觀察到了轉(zhuǎn)基因植株中的GFP基因的表達(dá)。
　　 ⑵文獻(xiàn)表明血紅蛋白能促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)、提高煙草葉中葉綠素與尼古丁的含量。本研究以藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis sp.PCC6803)為材料，采用PCR技術(shù)從藍(lán)細(xì)菌的基因組DNA中克隆了SLR2097基因的ORF，此ORF全長(zhǎng)375 bp，

6、編碼一個(gè)由123個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈，推測(cè)其編碼的多肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量為30.39kD，理論等電點(diǎn)為5.26。比較藍(lán)細(xì)菌的SLR2097與其它13種生物的血紅蛋白基因編碼的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，這些生物的SLR2097基因編碼的氨基酸序列的保守性非常低，除了有一個(gè)共同的基序F-[LF]-x(4)-[G]-G-[PAT]-x(2)-[YW]-x-[GSE]-x(1，5)-[LW]-x(3)-H之外，幾乎再?zèng)]有共同的序列。
　　 ⑶構(gòu)