p53基因codon72多態(tài)性與剖腹產(chǎn)術(shù)后瘢痕增生的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　 皮膚作為人體面積最大的器官擔(dān)負(fù)著保護(hù)人體內(nèi)部結(jié)構(gòu)和各大臟器系統(tǒng)的重要功能。一旦受到損傷,皮膚就會迅速的產(chǎn)生各種應(yīng)激性反應(yīng),最終達(dá)到瘢痕愈合。瘢痕是人體創(chuàng)傷后自身修復(fù)的必然產(chǎn)物,沒有瘢痕形成就沒有愈合,瘢痕是臨床愈合的標(biāo)志。瘢痕只有在過度增生等情況下,引起機(jī)體不適或造成畸形及功能障礙時(shí),才被認(rèn)為是病理現(xiàn)象。引起病理現(xiàn)象的瘢痕稱之為病理性瘢痕,是在創(chuàng)傷愈合過程中,受局部微環(huán)境的影響,基因的表達(dá)發(fā)生變化,從而影響到瘢

2、痕的轉(zhuǎn)歸。臨床多見的有增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩。由于增生性瘢痕與瘢痕疙瘩在臨床表現(xiàn)上極其相似,人們很易混淆兩種疾病的概念。以往研究已證實(shí),瘢痕疙瘩除了具有一般病理性瘢痕的特性外,還有著“腫瘤樣生長”傾向、病變超出原損傷區(qū)、有特殊的高發(fā)部位、手術(shù)切除后極易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。而增生性瘢痕多半是局部性生長,病變不超出原損傷區(qū)。其發(fā)生均為機(jī)體自身過度修復(fù)的結(jié)果。
　　 病理性瘢痕的主要病理表現(xiàn)為瘢痕組織內(nèi)膠原及基質(zhì)成分的大量沉積。其發(fā)病機(jī)制迄今未

3、明,臨床上瘢痕疙瘩的發(fā)病可以是因?yàn)橐恍┓浅］p微的損傷(如穿耳、注射或暗瘡破潰)或是無明顯的誘因,表現(xiàn)為病程長,多持續(xù)增長,無自行萎縮傾向。青壯年多發(fā),好發(fā)于耳垂、前胸、上頸區(qū)、肩以及女性剖腹產(chǎn)傷口的恥骨聯(lián)合部等特殊部位。其病程長,不斷擴(kuò)增,有時(shí)伴有痛癢癥狀的表現(xiàn)；而增生性瘢痕,不超出病損區(qū),增生可以自限,但病程時(shí)間亦較長。在暴露部位的病理性瘢痕影響美觀,造成容貌損害等等,均給患者造成嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)。病理性瘢痕是目前整形外科的常見病,治療

4、方法有限,尤其是瘢痕疙瘩,人們嘗試用不同的方法來治療瘢痕疙瘩,但遺憾的是,到目前為止無論是手術(shù)治療還是非手術(shù)治療,或者是聯(lián)合治療,仍然沒有一種完善的治療方案可以獲得穩(wěn)定又滿意的療效。雖然病理性瘢痕是一種良性疾患,但是它的病理特點(diǎn)和臨床特征給患者帶來了生理和心理上的痛苦。臨床上缺乏滿意的治療手段,也給整形外科醫(yī)師帶來了工作上的困擾。
　　 如何預(yù)測和干擾瘢痕疙瘩的形成一直是本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩外周血淋巴

5、細(xì)胞中p53基因外顯子4第72位密碼予的基因型分布存在多態(tài)性,而且這種多態(tài)性分布在普通人群及瘢痕疙瘩人群中存在差異。這種分布的差異為臨床篩選瘢痕疙瘩易感人群提供了理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí),為進(jìn)一步推動(dòng)研究的臨床應(yīng)用,前課題組在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上,成功研制了p53基因檢測試劑盒。該試劑盒是應(yīng)用ASO(等位基因特異性寡核苷酸探針法)及PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)來對p53基因外顯子4第72位密碼子的基因型進(jìn)行鑒別。
　　 前課題組應(yīng)用該試劑盒

6、通過提取DNA樣本；設(shè)計(jì)擴(kuò)增p53基因外顯子4片段的引物,多聚酶鏈反應(yīng)對DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增；設(shè)計(jì)與外顯子4第72位密碼子兩種不同等位基因相吻合的探針,制備顯色膜條,應(yīng)用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù),通過三種不同的顯色結(jié)果判定待檢者p53基因外顯子4第72位密碼子的基因型。最后統(tǒng)計(jì)分析三種基因型的分布差異,得出結(jié)論:人類p53基因外顯子4中72位密碼子C等位基因及CC基因型可能是中國廣東地區(qū)漢族人群瘢痕疙瘩的易感因素,瘢痕疙瘩p53基因檢測試劑盒是一

7、種可以初步預(yù)測瘢痕疙瘩易感人群的檢測手段。
　　 有文獻(xiàn)報(bào)道,亞洲黃色人種瘢痕疙瘩臨床發(fā)病率在2.3‰,而增生性瘢痕的發(fā)生率明顯高于瘢痕疙瘩,雖然無向正常皮膚浸潤、持續(xù)增生的病理特征,但臨床表現(xiàn)極為相似,同樣困擾患者,影響他們的日常生活。在p53基因異常表達(dá)方面的研究,有學(xué)者報(bào)道,增生性瘢痕與瘢痕疙瘩之間無顯著性差異；在p53基因多態(tài)性的研究中有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CCC/CCC基因型者增生性瘢痕的發(fā)生率提高。于是我們考慮在檢測p53基因c

8、odon72多態(tài)性篩查易感人群時(shí),將增生性瘢痕納入其中,統(tǒng)稱為病理性瘢痕的易感人群的篩查。目前臨床上尚無預(yù)測病理性瘢痕易感人群的檢測手段,本課題旨在通過研究p53 codon72多態(tài)性與病理性瘢痕的相關(guān)性,用更準(zhǔn)確快速的方法檢測易感人群,為臨床患者做好預(yù)防性治療奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　 1.建立熒光分子信標(biāo)PCR檢測P53基因SNP的方法(熒光探針標(biāo)記法),提高準(zhǔn)確率,簡化操作,降低成本,縮短時(shí)間,使之更易于臨

9、床推廣。
　　 2.應(yīng)用熒光分子信標(biāo)PCR法對剖腹產(chǎn)女性進(jìn)行大樣本量p53基因codon72多態(tài)性的臨床篩查,并對受測者進(jìn)行臨床隨訪,觀察臨床患者瘢痕轉(zhuǎn)歸與基因型的相符性。為臨床預(yù)測病理性瘢痕的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。
　　 研究對象及方法:
　　 研究對象:一組為瘢痕疙瘩組,收集臨床上已知的瘢痕疙瘩患者28例。另一組為剖腹產(chǎn)術(shù)后組,收集260例剖腹產(chǎn)術(shù)后女性(剛做完剖腹產(chǎn)一周內(nèi)的產(chǎn)婦)的外周靜脈血樣本及相關(guān)臨床資料。

10、選擇剖腹產(chǎn)女性,手術(shù)部位較恒定。兩組排除了病理性瘢痕及腫瘤史。實(shí)驗(yàn)方法:抽取待測人群的外周靜脈血,提取全血中的DNA樣本；兩組均采用分子信標(biāo)熒光PCR法檢測P53基因codon72多態(tài)性.瘢痕疙瘩組設(shè)計(jì)一對p53基因第4外顯子的第72密碼子單核苷酸多態(tài)性(SNP)熒光分子信標(biāo)探針,用Fam熒光分子標(biāo)記CCC,用hex熒光分子標(biāo)記CGC,在定量熒光PCR(Real—time PCR)儀檢測該位點(diǎn)SNP,并與反向斑點(diǎn)雜交法,DNA直接測序等

11、方法比較。根據(jù)已知p53基因72密碼子SNP基因型樣本的熒光定量測定結(jié)果,制定以下判別標(biāo)準(zhǔn):以熒光強(qiáng)度≥空白管熒光強(qiáng)度2.0倍為陽性反應(yīng)。單純MBC探針(Fam綠色熒光)陽性判定為CCC/CCC純合子；單純MBG探針(HEX紅色熒光)陽性判定為CGC/CGC純合子；MBC探針(Fam綠色熒光)和MBG探針(HEX紅色熒光)雙陽性判定為CCC/CGC雜合子。通過三種不同的熒光顯色結(jié)果判定待檢者p53基因外顯子4第72位密碼子的基因型,通過

12、比較,判斷這種方法的優(yōu)勢。剖腹產(chǎn)術(shù)后組用分子信標(biāo)熒光PCR法檢測p53基因codon72多態(tài)性,并統(tǒng)計(jì)分析三種基因型的分布差異,結(jié)合臨床隨訪結(jié)果,觀察基因型與臨床病理性瘢痕的患病關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 本組實(shí)驗(yàn)共檢測了臨床瘢痕疙瘩組28例及剖腹產(chǎn)術(shù)后組260例的血樣本中的p53基因codon72基因表達(dá)。瘢痕疙瘩組中p53基因外顯子4第72位密碼子顯示基因型為C/C型為12人,占總數(shù)的42.87％；顯示基因型為C

13、/G型為10人,占總數(shù)的35.71％；顯示基因型為G/G型為6人,占總數(shù)的21.43％。與DNA測序結(jié)果相同；再用反向斑點(diǎn)雜交法測試,顯示三種基因型分別為C/C14例、C/G9例、G/G6例,與DNA測序結(jié)果吻合率為92.86％。分子信標(biāo)熒光PCR法檢測結(jié)果與DNA測序結(jié)果吻合,準(zhǔn)確率為100％,高于反向斑點(diǎn)雜交法的為92.86％。分子信標(biāo)法的靈敏度為42.86％,特異性為87.5％；反向斑點(diǎn)法的靈敏度為50％,特異性為83.34％。分

14、子信標(biāo)法的靈敏度低于反向斑點(diǎn)雜交法,但特異性高于反向斑點(diǎn)雜交法。
　　 統(tǒng)計(jì)剖腹產(chǎn)術(shù)后組與術(shù)后瘢痕增生組的基因型分布情況為:剖腹產(chǎn)術(shù)后組中p53基因codon72顯示基因型為脯氨酸(C)/脯氨酸(C)型為46人,占總數(shù)的19.3％；顯示基因型為脯氨酸(C)/精氨酸(G)型為117人,占總數(shù)的49.2％；顯示基因型為精氨酸(G)/精氨酸(G)型為75人,占總數(shù)的31.5％。臨床隨訪260例女性,發(fā)生瘢痕增生的22例,其對應(yīng)的基因型

15、分別是C/C型9例,占患病人數(shù)的40.996,C/G型8例,占患病人數(shù)的36.36％,G/G型5例,占患病人數(shù)的22.72％。行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:臨床上應(yīng)用分子信標(biāo)熒光PCR法對手術(shù)創(chuàng)傷后女性做p53基因codon72多態(tài)性的檢測,基因型為C/C的產(chǎn)婦與基因型為C/G+G/G術(shù)后發(fā)生病理性瘢痕的風(fēng)險(xiǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且高于基因型為C/G+G/G的產(chǎn)婦(P<0.05)。C/C純合子與其他基因型相比較,與病理性瘢痕有較高的相關(guān)性,存在

16、病理性瘢痕患病風(fēng)險(xiǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 人類p53基因第72位密碼子多態(tài)性位點(diǎn)的基因型檢測對發(fā)現(xiàn)病理性瘢痕的易感人群有臨床指導(dǎo)意義；熒光探針標(biāo)記法更新了瘢痕疙瘩p53基因檢測試劑盒的方法,準(zhǔn)確率高,更方便快捷,可以作為預(yù)測病理性瘢痕易感人群的檢測手段,為臨床上預(yù)測病理性瘢痕的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提供一種新方法。
　　 臨床意義：
　　 推廣和應(yīng)用,為臨床預(yù)測病理性瘢痕易感人群提供一種可能。對手術(shù)后女性前瞻性研究

17、表明對病理性瘢痕易感人群的篩查,有臨床指導(dǎo)意義。為需要手術(shù)的患者預(yù)測病理性瘢痕的患病風(fēng)險(xiǎn),提前做好瘢痕的預(yù)防性治療,盡量減少病理性瘢痕發(fā)生的可能性。一旦檢測出陽性結(jié)果,對于未發(fā)病的瘢痕疙瘩易感者可以給予盡早的警示,盡量避免穿耳、擠破暗瘡等不必要的損傷,降低患病風(fēng)險(xiǎn),及時(shí)給予臨床工作者避免瘢痕增生的警示和增強(qiáng)易感者自我防治的意識。PCR熒光分子信標(biāo)檢測技術(shù)優(yōu)于PCR-反向斑點(diǎn)雜交法,更適合臨床p53基因codon72 SNP快速診斷。瘢痕