百合地黃湯對(duì)血清剝奪培養(yǎng)下PC-12細(xì)胞的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的:
　　 百合地黃湯源自張仲景《金匱要略》，是用于治療百合病的主方。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)百合地黃湯干預(yù)血清剝奪法致PC-12細(xì)胞損傷模型，觀察分析細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、ATP/蛋白總量、細(xì)胞膜電位等變化，研究該復(fù)方對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 方法:
　　 (1)實(shí)驗(yàn)藥物:百合地黃湯為百合與地黃按4∶3比例組方，水煎劑濃縮至浸膏，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋。
　　 (2)實(shí)驗(yàn)對(duì)象:PC-12細(xì)胞是神經(jīng)疾病體外研究常用細(xì)胞株

2、之一，具有神經(jīng)細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞的雙重生理特性。細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);培養(yǎng)基為RPMI-1640添加10％胎牛血清。
　　 (3)細(xì)胞模型:采用血清剝奪法培養(yǎng)PC-12細(xì)胞（即培養(yǎng)基中不添加血清），制作營(yíng)養(yǎng)缺乏細(xì)胞模型。
　　 (4)細(xì)胞分組及藥物作用時(shí)間:細(xì)胞分為正常組（正常血清對(duì)照組）、正常+藥物組（正常血清+百合地黃湯組）、模型組（血清剝奪組）、模型+藥物組（血清剝奪+百合地黃湯組），藥物作用時(shí)間均為24h。

3、
　　 (5) MTT實(shí)驗(yàn):將不同濃度百合地黃湯干預(yù)PC-12細(xì)胞，篩選適宜的藥物濃度與作用時(shí)間。
　　 (6)細(xì)胞顯微形態(tài)觀察:用倒置相差顯微鏡觀察各組培養(yǎng)細(xì)胞。
　　 (7)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察:用透射電鏡觀察各組培養(yǎng)細(xì)胞。
　　 (8) ATP含量/細(xì)胞蛋白總量測(cè)定:用螢火蟲(chóng)熒光素酶法測(cè)定各組細(xì)胞的ATP含量;用BCA法測(cè)定各組細(xì)胞的蛋白總量。
　　 (9)細(xì)胞膜電位檢測(cè):各組分別用細(xì)胞膜電位熒

4、光探針diBAC4(3)標(biāo)記，用激光掃描共聚焦顯微術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。
　　 (10)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 (1)實(shí)驗(yàn)條件:百合地黃湯適宜濃度為3mg/ml，藥物作用時(shí)間為24h。
　　 (2)細(xì)胞顯微形態(tài)的變化:模型組細(xì)胞貼壁數(shù)量較少，細(xì)胞體積較小，說(shuō)明細(xì)胞狀態(tài)較差;模型+藥物組細(xì)胞貼壁數(shù)量明顯增多，細(xì)胞體積較大，說(shuō)明在百合地黃湯干預(yù)下，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯改善。
　　 (3)細(xì)胞超

5、微結(jié)構(gòu)的變化:模型組細(xì)胞胞飲泡增多、自噬泡可見(jiàn)，空泡較多，說(shuō)明細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不足;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上核糖體顆粒脫落、線粒體數(shù)量減少，細(xì)胞核收縮變形、染色質(zhì)聚集，提示細(xì)胞蛋白質(zhì)合成障礙、細(xì)胞損傷。模型+藥物組細(xì)胞的細(xì)胞核、胞質(zhì)及其中細(xì)胞器均有明顯改善，說(shuō)明百合地黃湯干預(yù)后，營(yíng)養(yǎng)狀況得到改善，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好。
　　 (4)細(xì)胞蛋白總量的變化:模型+藥物組細(xì)胞蛋白總量顯著高于模型組，并可達(dá)到干預(yù)前的水平，表明了在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，藥物干預(yù)可顯著減少細(xì)

6、胞蛋白質(zhì)的降解，說(shuō)明了百合地黃湯對(duì)該細(xì)胞有很好的營(yíng)養(yǎng)作用。
　　 (5)細(xì)胞ATP含量的變化:模型+藥物組的ATP熒光強(qiáng)度/蛋白總量吸光度比值，明顯高于模型組，正常+藥物組也明顯高于正常組，說(shuō)明百合地黃湯干預(yù)對(duì)于增加細(xì)胞ATP的合成，改善細(xì)胞能量代謝方面，有較好的效果。
　　 (6)細(xì)胞膜電位的變化:熒光探針diBAC4(3)的特性是，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞膜電位呈負(fù)相關(guān)。細(xì)胞處于貼壁展開(kāi)狀態(tài)時(shí)，熒光較暗，熒光強(qiáng)度平均值小，表明

7、膜電位大，細(xì)胞狀態(tài)好;細(xì)胞收縮變圓時(shí)，熒光較亮，熒光強(qiáng)度平均值大，顯示膜電位小，表明細(xì)胞受損、狀態(tài)差。
　　 模型組大多數(shù)細(xì)胞已收縮變圓，細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度較高，說(shuō)明細(xì)胞膜電位較小，提示在模型組尚存活的生長(zhǎng)狀態(tài)不佳的細(xì)胞中，細(xì)胞膜電位減小，只須較弱的刺激就可能引起細(xì)胞興奮;模型+藥物組中貼壁展開(kāi)的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞平均熒光較小，表明細(xì)胞膜電位較大，提示細(xì)胞狀態(tài)改善后，細(xì)胞膜電位增大，與域電位的距離增大，神經(jīng)細(xì)胞興奮性降低。

8、r>　　 結(jié)論:
　　 (1)血清剝奪培養(yǎng)可造成PC-12損傷、死亡，適當(dāng)濃度的百合地黃湯能夠提高PC-12細(xì)胞的存活率，改善細(xì)胞器和細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高蛋白、ATP含量，并有助于細(xì)胞維持較大的細(xì)胞膜電位，提示對(duì)于細(xì)胞外環(huán)境營(yíng)養(yǎng)方面不利因素造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡，在形態(tài)結(jié)構(gòu)、物質(zhì)能量基礎(chǔ)、生理機(jī)能以及細(xì)胞存活率等多方面，該復(fù)方都有較好的保護(hù)作用。
　　 (2)百合地黃湯有助于PC-12細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)條件不利時(shí)維持較大的細(xì)