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文檔簡介
1、目的:
百合地黃湯源自張仲景《金匱要略》,是用于治療百合病的主方。本實驗主要通過百合地黃湯干預(yù)血清剝奪法致PC-12細(xì)胞損傷模型,觀察分析細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、ATP/蛋白總量、細(xì)胞膜電位等變化,研究該復(fù)方對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。
方法:
(1)實驗藥物:百合地黃湯為百合與地黃按4∶3比例組方,水煎劑濃縮至浸膏,使用時用培養(yǎng)基稀釋。
(2)實驗對象:PC-12細(xì)胞是神經(jīng)疾病體外研究常用細(xì)胞株
2、之一,具有神經(jīng)細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞的雙重生理特性。細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫;培養(yǎng)基為RPMI-1640添加10%胎牛血清。
(3)細(xì)胞模型:采用血清剝奪法培養(yǎng)PC-12細(xì)胞(即培養(yǎng)基中不添加血清),制作營養(yǎng)缺乏細(xì)胞模型。
(4)細(xì)胞分組及藥物作用時間:細(xì)胞分為正常組(正常血清對照組)、正常+藥物組(正常血清+百合地黃湯組)、模型組(血清剝奪組)、模型+藥物組(血清剝奪+百合地黃湯組),藥物作用時間均為24h。
3、
(5) MTT實驗:將不同濃度百合地黃湯干預(yù)PC-12細(xì)胞,篩選適宜的藥物濃度與作用時間。
(6)細(xì)胞顯微形態(tài)觀察:用倒置相差顯微鏡觀察各組培養(yǎng)細(xì)胞。
(7)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察:用透射電鏡觀察各組培養(yǎng)細(xì)胞。
(8) ATP含量/細(xì)胞蛋白總量測定:用螢火蟲熒光素酶法測定各組細(xì)胞的ATP含量;用BCA法測定各組細(xì)胞的蛋白總量。
(9)細(xì)胞膜電位檢測:各組分別用細(xì)胞膜電位熒
4、光探針diBAC4(3)標(biāo)記,用激光掃描共聚焦顯微術(shù)檢測各組細(xì)胞熒光強度。
(10)統(tǒng)計學(xué)分析。
結(jié)果:
(1)實驗條件:百合地黃湯適宜濃度為3mg/ml,藥物作用時間為24h。
(2)細(xì)胞顯微形態(tài)的變化:模型組細(xì)胞貼壁數(shù)量較少,細(xì)胞體積較小,說明細(xì)胞狀態(tài)較差;模型+藥物組細(xì)胞貼壁數(shù)量明顯增多,細(xì)胞體積較大,說明在百合地黃湯干預(yù)下,細(xì)胞生長狀態(tài)明顯改善。
(3)細(xì)胞超
5、微結(jié)構(gòu)的變化:模型組細(xì)胞胞飲泡增多、自噬泡可見,空泡較多,說明細(xì)胞營養(yǎng)不足;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上核糖體顆粒脫落、線粒體數(shù)量減少,細(xì)胞核收縮變形、染色質(zhì)聚集,提示細(xì)胞蛋白質(zhì)合成障礙、細(xì)胞損傷。模型+藥物組細(xì)胞的細(xì)胞核、胞質(zhì)及其中細(xì)胞器均有明顯改善,說明百合地黃湯干預(yù)后,營養(yǎng)狀況得到改善,細(xì)胞生長狀態(tài)較好。
(4)細(xì)胞蛋白總量的變化:模型+藥物組細(xì)胞蛋白總量顯著高于模型組,并可達(dá)到干預(yù)前的水平,表明了在營養(yǎng)缺乏時,藥物干預(yù)可顯著減少細(xì)
6、胞蛋白質(zhì)的降解,說明了百合地黃湯對該細(xì)胞有很好的營養(yǎng)作用。
(5)細(xì)胞ATP含量的變化:模型+藥物組的ATP熒光強度/蛋白總量吸光度比值,明顯高于模型組,正常+藥物組也明顯高于正常組,說明百合地黃湯干預(yù)對于增加細(xì)胞ATP的合成,改善細(xì)胞能量代謝方面,有較好的效果。
(6)細(xì)胞膜電位的變化:熒光探針diBAC4(3)的特性是,熒光強度與細(xì)胞膜電位呈負(fù)相關(guān)。細(xì)胞處于貼壁展開狀態(tài)時,熒光較暗,熒光強度平均值小,表明
7、膜電位大,細(xì)胞狀態(tài)好;細(xì)胞收縮變圓時,熒光較亮,熒光強度平均值大,顯示膜電位小,表明細(xì)胞受損、狀態(tài)差。
模型組大多數(shù)細(xì)胞已收縮變圓,細(xì)胞平均熒光強度較高,說明細(xì)胞膜電位較小,提示在模型組尚存活的生長狀態(tài)不佳的細(xì)胞中,細(xì)胞膜電位減小,只須較弱的刺激就可能引起細(xì)胞興奮;模型+藥物組中貼壁展開的細(xì)胞數(shù)量明顯增多,細(xì)胞平均熒光較小,表明細(xì)胞膜電位較大,提示細(xì)胞狀態(tài)改善后,細(xì)胞膜電位增大,與域電位的距離增大,神經(jīng)細(xì)胞興奮性降低。
8、r> 結(jié)論:
(1)血清剝奪培養(yǎng)可造成PC-12損傷、死亡,適當(dāng)濃度的百合地黃湯能夠提高PC-12細(xì)胞的存活率,改善細(xì)胞器和細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu),提高蛋白、ATP含量,并有助于細(xì)胞維持較大的細(xì)胞膜電位,提示對于細(xì)胞外環(huán)境營養(yǎng)方面不利因素造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡,在形態(tài)結(jié)構(gòu)、物質(zhì)能量基礎(chǔ)、生理機能以及細(xì)胞存活率等多方面,該復(fù)方都有較好的保護(hù)作用。
(2)百合地黃湯有助于PC-12細(xì)胞在營養(yǎng)條件不利時維持較大的細(xì)
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