多孔菌抗腫瘤活性評(píng)價(jià)及巨多孔菌有效成分分離、結(jié)構(gòu)鑒定及誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理研究.pdf

1、多孔菌是屬于擔(dān)子菌亞門(mén)的一類(lèi)大型真菌，它們與子囊菌亞門(mén)的一些種共同構(gòu)成了高等真菌藥用活性物質(zhì)的主要來(lái)源。為了開(kāi)發(fā)利用我國(guó)的多孔菌資源，本論文對(duì)多孔菌進(jìn)行了以下研究： 1、對(duì)浙江、湖南兩省的藥用多孔菌資源進(jìn)行了調(diào)查、采集、鑒定，并采用MTT法詳細(xì)評(píng)價(jià)了35種多孔菌對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa及人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的體外抗腫瘤活性。結(jié)果表明，所有參試材料的甲醇和水提取物均未顯示細(xì)胞毒性(IC<,50>>100μg/ml)，但有

2、21種多孔菌子實(shí)體的石油醚和乙酸乙酯提取物顯示了不同強(qiáng)度的體外抗腫瘤活性(34<50μg/ml)。選定活性最強(qiáng)的巨多孔菌(IC<,50>=34.2μg/ml)作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。 2、研究了巨多孔菌的生物學(xué)特性。結(jié)果顯示，巨多孔菌實(shí)體的發(fā)生對(duì)土壤肥力要求不高，但是與降雨關(guān)系密切；適宜子實(shí)體生長(zhǎng)的土壤濕度為40％-60％，光照以散射光

3、為宜。對(duì)巨多孔菌生物學(xué)特性的了解有助于我們對(duì)該種進(jìn)行引種和馴化。 3、用活性跟蹤分離的方法，對(duì)巨多孔菌乙酸乙酯提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了有目的分離，得到一個(gè)具較強(qiáng)細(xì)胞毒活性的單體clitocine；另外，還鑒定了clitocine的一個(gè)無(wú)活性構(gòu)象異構(gòu)體α-clitocine。本研究首次報(bào)道的clitocine是巨多孔菌中的主要細(xì)胞毒活性物質(zhì)。a-clitocine首次以天然產(chǎn)物的形式被報(bào)道。 4、評(píng)價(jià)了clitocine的體

4、內(nèi)、外抗腫瘤活性。結(jié)果表明，clitocine對(duì)體外培養(yǎng)的人宮頸癌細(xì)胞Hela、人肝癌SMMC-7721、人乳腺癌Bcap-37和MCF-7、人胃癌細(xì)胞株SGC-7901均有增殖抑制作用，并具有一定選擇性，對(duì)SMMC-7721的抑制作用最強(qiáng)(IC<,50?=1.1μM)，對(duì)MCF-7的作用較弱(IC<,50>=43.0μM)。小鼠體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)顯示，clitocine對(duì)小鼠S180肉瘤沒(méi)有顯著抑制作用。首次發(fā)現(xiàn)clitocine對(duì)小鼠天

5、然免疫器官一脾臟具有強(qiáng)烈的抑制作用。 5、首次探討了clitocine誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞HeIa死亡的作用機(jī)理，獲得了一些有意義的發(fā)現(xiàn)。151xM clitocine作用HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)了時(shí)間依賴(lài)的凋亡；Clitocine誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有典型的凋亡特征，如核形態(tài)的變化，DNA片斷的產(chǎn)生，caspase的激活，PARP裂解，細(xì)胞色素c釋放等；Clitocine處理激活了caspase-3、8、9，在48h內(nèi)caspase家族抑制劑

6、(Z-VAD-FMK)，caspase-3抑制劑(Z-DEVD-FMK)，caspase-9 inhibitor(Z-LEHD-FMK)均可顯著抑制clitocine誘導(dǎo)的死亡；Clitocine可明顯上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。研究還表明clitocine誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞死亡發(fā)生在細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)期，對(duì)周期無(wú)阻滯作用。因此，初步認(rèn)為，clitocine誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是由caspase家族和Bcl-2