犬下頜牽張成骨、新生犬與成年犬的骨組織mRNA表達(dá)譜差異分析.pdf

1、目的:研究牽張成骨區(qū)骨組織、新生幼犬骨組織與成年犬骨組織的基因表達(dá)差異情況，從而找到牽張成骨期間可能激活的與新生發(fā)育期成血管及成骨有關(guān)的因子及信號(hào)通路。使驗(yàn)證臨床牽張成骨的成骨速度是嬰幼兒骨生長(zhǎng)發(fā)育速度的4-6倍的原因成為可能。
　　方法:1.將6只犬隨機(jī)分成牽張成骨固定0周組及對(duì)照組（未作處理成年犬）。牽張成骨固定0周組行單線DO牽張手術(shù)，于手術(shù)后1周開始牽張，每天1mm，牽張1周，于牽張結(jié)束當(dāng)天處死動(dòng)物并收集標(biāo)本，對(duì)照組直接處

2、死動(dòng)物并收集標(biāo)本。另選取新生半小時(shí)內(nèi)幼犬3只作為新生組，處死動(dòng)物并收集標(biāo)本。利用大體觀、CBCT技術(shù)、HE染色法觀察標(biāo)本。
　　2.提取三組標(biāo)本總RNA，建立cDNA文庫(kù)，用Hiseq4000平臺(tái)對(duì)上述三組進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估、序列比對(duì)分析，基因表達(dá)水平分析;檢測(cè)差異基因表達(dá)情況并對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集，以此對(duì)其功能富集情況進(jìn)行了解。
　　結(jié)果:所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均順利完成手術(shù)及術(shù)后的牽張過程。術(shù)后無(wú)動(dòng)物死亡現(xiàn)象

3、，傷口愈合良好，無(wú)感染等不良情況，未發(fā)現(xiàn)牽張器松脫、斷裂現(xiàn)象，固定良好。
　　1.大體觀:DO-0組:牽張區(qū)域內(nèi)未見新骨形成，由肉芽組織充填，質(zhì)地較軟。
　　2.CBCT觀察:牽張區(qū)未見白色阻射影，無(wú)新骨形成，缺隙兩側(cè)邊界清晰。
　　3.RNA樣品質(zhì)量檢測(cè):RNA條帶清晰，無(wú)雜質(zhì)污染，完整性較好，降解率低。
　　4.HE染色: DO-0組:牽張間隙內(nèi)為肉芽組織，鏡下見大量毛細(xì)血管增生。兩側(cè)骨段端見新生骨小梁和骨基

4、質(zhì)，骨小梁較細(xì)小，骨基質(zhì)周緣有大量成骨細(xì)胞但排列不規(guī)則。P-0組:骨小梁較幼稚、細(xì)小，骨基質(zhì)周圍有成骨細(xì)胞，鏡下見大量毛細(xì)血管增生。Normal組:骨小梁粗大，成骨細(xì)胞明顯減少。膠原纖維粗大并可見成熟的哈弗氏系統(tǒng)。
　　5.測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估:(1) A/T/G/C堿基含量分布統(tǒng)計(jì):三個(gè)樣本文庫(kù)堿基分布均勻，N％在合理范圍之內(nèi)。(2)堿基質(zhì)量分布統(tǒng)計(jì):所獲得測(cè)序數(shù)據(jù)達(dá)到后續(xù)分析要求。(3)堿基錯(cuò)誤率分布統(tǒng)計(jì):錯(cuò)誤率均小于0.1％。<

5、br>　　6.序列比對(duì)結(jié)果:Normal組比對(duì)率是57.06％; DO-0組比對(duì)率是52.55％;P-0組比對(duì)率是47.37％。三個(gè)樣品的比對(duì)率尚可，可以進(jìn)行后續(xù)分析。
　　7.隨機(jī)性評(píng)估:reads在基因各部分分布符合中間深兩端低的布局，說明基因片段打斷隨機(jī)性好，測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果可進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。
　　8.差異表達(dá)基因檢測(cè)結(jié)果:在Normal組與P-0組、DO-0組的對(duì)比中找到253個(gè)顯著性差異表達(dá)基因，其中表達(dá)下調(diào)

6、的有175個(gè)，表達(dá)上調(diào)的有78個(gè)。
　　9.GO富集分析結(jié)果:對(duì)Normal組與P-0、DO-0組對(duì)比表達(dá)上調(diào)的差異基因進(jìn)行GO富集分析，其中與細(xì)胞代謝相關(guān)的基因高表達(dá)。對(duì)Normal組與DO-0組對(duì)比中表達(dá)上調(diào)的差異基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞的增殖、遷移，血管形成、生長(zhǎng)發(fā)育等相關(guān)的基因高表達(dá)。
　　結(jié)論:發(fā)現(xiàn)DO-0組、P-0組與Normal組的差異表達(dá)基因有253個(gè)，其中上調(diào)的有78個(gè)，下調(diào)的有175個(gè)，且在上調(diào)的