大鼠矽肺差異蛋白的篩選及S100A8在矽肺纖維化中作用的實驗研究.pdf

1、目的：本研究通過制備不同時期的矽肺大鼠模型，利用蛋白質組學中的雙向凝膠電泳和質譜分析技術，探討在不同時期矽肺大鼠肺組織中均呈明顯差異表達的蛋白種類，并挑選其中評分最高的一種蛋白（S100A8）在矽肺動物模型和細胞水平加以驗證，了解 S100A8與矽肺的相關性，為矽肺的發(fā)病機制的進一步研究提供實驗依據(jù)。
　　方法：1、大鼠矽肺模型的復制：SPF級雄性 Wistar大鼠90只適應性飼養(yǎng)一周，隨機分為2組，模型組（即染矽塵組）60只、空

2、白對照組30只。模型組利用非暴露氣管法一次性灌注 SiO2懸液復制矽肺模型，空白對照組以滅菌生理鹽水替代。建模時間記為0周，于染塵后1周、2周、3周、4周、6周和8周6個時間點處死模型組10只和空白對照組5只大鼠，同時肉眼觀察大鼠肺臟病理變化，迅速取出肺組織，大部分保存在液氮中備用，并將余下肺組織甲醛固定以鑒定造模是否成功及免疫組化檢查；2、矽肺差異蛋白的篩選：利用雙向電泳技術篩選矽肺的差異蛋白點，對所篩選的部分差異蛋白進行質譜分析；挑

3、選其中評分最高的差異蛋白S100A8進行驗證；3、矽肺差異蛋白的驗證：①制作大鼠模型組和空白對照組肺組織的石蠟切片，免疫組織化學檢測 S100A；②提取大鼠模型組和空白對照組的肺組織總蛋白及RNA；③再選SPF級雄性Wistar大鼠建立矽肺模型，支氣管肺泡灌洗獲取肺泡巨噬細胞，用 SiO2進行刺激，18小時后收集上清液并保存；④體外肺纖維化模型的復制：胰酶消化法獲取肺成纖維細胞，培養(yǎng)至第4代，用收集的SiO2刺激的巨噬細胞上清進行刺激；

4、⑤制作細胞爬片，免疫細胞化學檢測S100A8；⑥提取體外纖維化模型和空白空白對照組細胞的總蛋白及 RNA；⑦Western-blot法和實時定量熒光PCR檢測S100A8在大鼠矽肺模型和細胞水平不同時間點的表達情況，應用自動圖像分析系統(tǒng)對結果進行圖像分析；4、應用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件，對實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較多組間均數(shù)進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：1、成功復制了大鼠矽肺模型；2、雙向電泳技術篩選出45個矽肺差異蛋白點，

5、選取其中7個點質譜分析結果得到6個差異蛋白；3、免疫組織化學和免疫細胞化學檢查：空白對照組 S100A8呈微弱表達，模型組 S100A8表達高于空白對照組，隨時間點增加而逐漸增強；4、Western-blot法檢測結果顯示S100A8在空白對照組呈弱表達，在大鼠矽肺模型和細胞水平中的表達均高于空白對照組且呈逐漸升高，且組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；5、實時定量熒光 PCR檢測結果顯示S100A8在空白對照組呈弱表達，在大鼠矽肺模