TO P K抑制劑抑制炎癥對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移灶克隆形成的促進(jìn)作用.pdf

1、目的：腫瘤轉(zhuǎn)移的最后階段，即轉(zhuǎn)移灶克隆形成（metastatic colonization），是最適合靶向治療的階段。由腫瘤或其他因素誘發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)可以激活腫瘤轉(zhuǎn)移休眠病灶促進(jìn)其轉(zhuǎn)移灶克隆形成。本文擬研究TOPK抑制劑除了抑制腫瘤細(xì)胞的作用外，是否通過干預(yù)腫瘤微環(huán)境、特別是干預(yù)腫瘤微環(huán)境中中性粒細(xì)胞的促瘤作用，從而產(chǎn)生更強(qiáng)地抑制腫瘤轉(zhuǎn)移灶克隆形成的效應(yīng)。
　　方法：（1）建立H22細(xì)胞荷瘤小鼠模型、B16F1腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型，

2、觀察不同劑量的TOPK抑制劑治療效果及其毒副作用；觀察shRNA轉(zhuǎn)染和TOPK抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。氣囊-LPS（Air-LPS）炎癥模型小鼠：接種經(jīng)CFSE染色的B16F1細(xì)胞，觀測(cè)肺組織冰凍切片熒光亮斑的數(shù)目；接種B16F1細(xì)胞，觀察不同時(shí)間段注射TOPK抑制劑對(duì)轉(zhuǎn)移病灶形成的治療作用。（2）ELISA檢測(cè)正常、荷瘤、Air-LPS炎癥小鼠血清炎癥相關(guān)因子的表達(dá)。正常、Air-LPS炎癥（建模后第14天）、荷瘤小鼠，以及在建立

3、兩種模型的過程中注射TOPK抑制劑的小鼠的骨髓或腹腔中性粒細(xì)胞，與H22細(xì)胞混合接種，觀察不同來源的中性粒細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。Air-LPS炎癥小鼠接種B16-F1細(xì)胞，同時(shí)腹腔注射anti-Ly6G單克隆抗體，觀察清除體內(nèi)中性粒細(xì)胞對(duì)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成的影響。（3）Air-LPS炎癥、以及在建模過程中注射TOPK抑制劑的小鼠，Real-time PCR檢測(cè)骨髓中性粒細(xì)胞促瘤相關(guān)基因Mmp-9、Bv8、Arg，iNos的表達(dá)；ELISA檢

4、測(cè)血清G-CSF、IL-6蛋白表達(dá)，Real-time PCR檢測(cè)脾細(xì)胞G-csf、Il-6的mRNA表達(dá)，觀察TOPK抑制劑是否抑制G-CSF和IL-6的表達(dá)；分離肌肉轉(zhuǎn)染pG-CSF/pIL-6（pG/pI6）質(zhì)粒小鼠的骨髓和腹腔中性粒細(xì)胞，與H22細(xì)胞混合接種，觀察TOPK抑制劑是否拮抗G-CSF/IL-6對(duì)中性粒細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。正常、pG/pI6的小鼠骨髓、腹腔中性粒細(xì)胞，以G-CSF和IL-6或腫瘤組織可溶性分子（T-sMs）

5、刺激，探討TOPK抑制劑對(duì)其基因表達(dá)的影響。（4）取正常、Air-LPS炎癥、pG/pI6小鼠、以及在建模過程中注射TOPK抑制劑的小鼠的骨髓和腹腔中性粒細(xì)胞，用real-time PCR法檢測(cè)抑瘤相關(guān)基因的表達(dá)；體外用T-Ms刺激，觀察TOPK抑制劑在抑瘤相關(guān)基因表達(dá)中的作用；用Western blot檢測(cè)p-p38MAPK和p38MAPK、p-PI3K和PI3K的蛋白水平，同時(shí)檢測(cè)MPO、NE釋放量，研究了TOPK抑制劑在中性粒細(xì)胞

6、PI3K和p38MAPK信號(hào)通路激活中，以及在脫顆粒能力的恢復(fù)中起到的作用。（5）取正常小鼠骨髓中性粒細(xì)胞，用G-CSF/IL-6和TOPK抑制劑或STAT3抑制劑體外刺激培養(yǎng)；取正常、Air-LPS炎癥小鼠的腹腔中性粒細(xì)胞，用T-sMs和TOPK抑制劑或STAT3抑制劑體外刺激培養(yǎng)；檢測(cè)中性粒細(xì)胞促瘤和抑瘤相關(guān)基因的表達(dá)。（6）取正常、Air-LPS炎癥小鼠的腹腔或骨髓中性粒細(xì)胞，用TOPK抑制劑或S TAT3抑制劑體外預(yù)處理1h，然

7、后用G-CSF/IL-6或T-sMs刺激6h；取正常、Air-LPS炎癥、pG/pI6小鼠的以及在模型制備過程中注射TOPK抑制劑或S TAT3抑制劑的小鼠的骨髓中性粒細(xì)胞；用Western blot檢測(cè)p-STAT3和STAT3、p-TOPK和TOPK的蛋白水平；用Real-time PCR檢測(cè)Stat3和Topk的。（7）用經(jīng)TGF-β1/H2O2/HOCl（T/H/H）刺激的非轉(zhuǎn)移性B16F0細(xì)胞（T/H/H-B16F0）接種Ai

8、r-LPS炎癥、EET小鼠建立肺微小休眠病灶模型，觀察炎癥、TOPK抑制劑對(duì)微小休眠病灶再生長(zhǎng)的影響；觀察體內(nèi)清除中性粒細(xì)胞，潛伏病灶是否重新生長(zhǎng)。
　　結(jié)果：（1）TOPK抑制劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯地抑制作用，高劑量（100mg/kg體重）具有明顯的毒副作用，該組小鼠體重呈下降趨勢(shì)。采用shRNA或TOPK抑制劑不能完全抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。低劑量（1mg/kg體重）TOPK抑制劑可完全抑制腫瘤轉(zhuǎn)移病灶的形成。肺組織冰凍切片結(jié)果表明，

9、Air-LPS炎癥不影響腫瘤細(xì)胞外滲；在制備炎癥小鼠及對(duì)其接種B16F1細(xì)胞全程采用TOP K抑制劑治療能有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移病灶的形成。（2）荷瘤、Air-LPS炎癥小鼠血清中G-CSF、IL-6和IL-1β濃度與正常組相比明顯升高。正常小鼠骨髓和腹腔中性粒細(xì)胞抑制腫瘤生長(zhǎng)，荷瘤、Air-LPS炎癥小鼠的顯著促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)；經(jīng)TOPK抑制劑治療的模型小鼠的中性粒細(xì)胞能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)。Air-LPS炎癥小鼠體內(nèi)清除中性粒細(xì)胞，其肺部表面不

10、能形成腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。（3）炎癥上調(diào)小鼠骨髓中性粒細(xì)胞Mmp-9、Bv8、Arg、iNos基因表達(dá)，而施加TOPK抑制劑干預(yù)可抑制這些基因的表達(dá)；TOPK抑制劑不影響Air-LPS炎癥小鼠血清G-CSF、IL-6和脾細(xì)胞G-csf、Il-6mRNA的表達(dá)水平的增高。TOPK抑制劑可抑制G-CSF/IL-6對(duì)中性粒細(xì)胞功能轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的誘導(dǎo)作用，使其抑制腫瘤的生長(zhǎng)。G-CSF/IL-6、T-sMs能刺激正常小鼠中性粒細(xì)胞Mmp9，Bv

11、8，Arg，iNos的mRNA表達(dá)，而TOPK抑制劑能夠降低G-CSF/IL-6、T-sMs的效應(yīng)。pG/pI6小鼠腹腔中性粒細(xì)胞高表達(dá)這些基因，T-sMs可進(jìn)一步上調(diào)這些基因的表達(dá)，而TOPK抑制劑仍可有效抑制其表達(dá)。（4）炎癥、pG/pI6下調(diào)小鼠中性粒細(xì)胞Trail和Rab27a基因表達(dá)，而TOPK抑制劑可上調(diào)其表達(dá)；TOPK抑制劑治療可使Trail和Rab27a基因表達(dá)恢復(fù)至正常小鼠水平；T-sMs刺激使pG/pI6小鼠腹腔中性

12、粒細(xì)胞中Trail和Rab27a基因表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，TOPK抑制劑使這些基因的表達(dá)呈升高趨勢(shì)。經(jīng)TOPK抑制劑治療后，Air-LPS炎癥、pG/pI6小鼠的腹腔中性粒細(xì)胞p38MAPK和PI3K的激活均可恢復(fù)至正常小鼠水平；同時(shí)MPO、NE的釋放增加。（5）TOPK抑制劑和STAT3抑制劑均可單獨(dú)拮抗G-CSF/IL-6對(duì)正常小鼠骨髓中性粒細(xì)胞Mmp9、Bv8、Arg、iNos基因表達(dá)的促進(jìn)作用，而上調(diào)了Trail、Rab27表達(dá)；也可

13、單獨(dú)降低正常、Air-LPS炎癥小鼠腹腔中性粒細(xì)胞對(duì)T-sMs的反應(yīng)性，使抑瘤相關(guān)基因表達(dá)水平下調(diào)，而Trail、Rab27a表達(dá)水平上調(diào)。（6）G-CSF/IL-6或T-sMs刺激均能提高STAT3、TOPK的激活水平，同時(shí)STAT3與TOPK互不影響對(duì)方的激活。炎癥、G-CSF/IL-6或pG/pI6可上調(diào)中性粒細(xì)胞的STAT3和TOPK的表達(dá)水平，而TOPK抑制劑、S TAT3抑制劑可明顯抑制對(duì)方的表達(dá)；同時(shí)p-STAT3和p-T

14、OPK的水平也下降。（7）Air-LPS炎癥、EET小鼠接種T/H/H-B16F0可形成大量可見的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)；在建模及接種過程中注射TOPK抑制劑，則僅在肺表面形成轉(zhuǎn)移潛伏病灶；體內(nèi)清除中性粒細(xì)胞亦可抑制潛伏病灶重新生長(zhǎng)。
　　結(jié)論：TOPK抑制劑不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力，而且還可通過影響炎癥微環(huán)境而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移病灶的形成。經(jīng)腫瘤或其他炎癥微環(huán)境誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)變?yōu)榇倭龉δ艿闹行粤＜?xì)胞在此過程的作用不可或缺。TOPK抑制劑作用于