熱療對(duì)紫杉醇抑制肺腫瘤細(xì)胞的促進(jìn)作用及其機(jī)制.pdf

1、肺癌的發(fā)病率和死亡率正在迅速上升,在很多發(fā)達(dá)國家,肺癌的發(fā)病率占男性常見惡性腫瘤的第一位,女性常見惡性腫瘤的第二、三位;肺癌的組織學(xué)類型也在發(fā)生顯著變化,腺癌的發(fā)病率不斷上升。雖然手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療、免疫治療及綜合治療等都取得了長足發(fā)展,但在美國肺癌患者5年的生存率僅為15％,歐洲不過是10％,發(fā)展中國家則不到8.9％?；熕幬镒仙即?TAX)抗腫瘤效果顯著,取得了較好的臨床療效。腫瘤熱療在腫瘤綜合治療中顯示了良好的效果,加熱

2、不會(huì)增加藥物的細(xì)胞毒性效應(yīng),所以,熱療增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性受到越來越多的重視,因此,本研究旨在驗(yàn)證熱療促進(jìn)TAX對(duì)肺腫瘤細(xì)胞抑制作用的發(fā)生及其機(jī)制。
　　研究方法：1.熱療與TAX聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肺部細(xì)胞生物學(xué)特性的影響采用人肺腺癌A549細(xì)胞、人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞和人呼吸道上皮BEAS-2B細(xì)胞,每種細(xì)胞分別采用3種方式處理,即對(duì)照組、TAX組和43℃+TAX組(見表1);倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),照相記錄,噻唑藍(lán)比色

3、法檢測(cè)細(xì)胞增殖率;提取細(xì)胞總蛋白,按LDH Kit要求檢測(cè)LDH活力,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞損傷修復(fù)能力,熒光Hoechst33342/PI雙染法以及提取細(xì)胞DNA Ladder檢測(cè)細(xì)胞凋亡。2.細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)傳導(dǎo)通路在熱療與TAX誘導(dǎo)肺腫瘤細(xì)胞增殖過程中的作用及其相互關(guān)系采用人肺腺癌A549細(xì)胞和人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞,每種細(xì)胞分別采用6種方式處理,即對(duì)照組、TAX組、43℃+TAX組(見表1)和SP600125組(43℃+TAX

4、組加入JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑SP600125)、wortmannin組(43℃+TAX組加入Akt通路抑制劑wortmannin)、NAC組(43℃+TAX組加入ROS抑制劑NAC);分別檢測(cè)各組ROS、p-JNK、p-Akt以及Caspase-3等的表達(dá)變化,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的變化,同時(shí)做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。3.HSP70在熱療與TAX抑制肺腫瘤細(xì)胞作用中的地位采用人肺腺癌A549細(xì)胞、人小細(xì)胞肺癌NCI-H446

5、細(xì)胞和人呼吸道上皮BEAS-2B細(xì)胞。每種細(xì)胞分別采用4種方式處理,即對(duì)照組、TAX組、43℃+TAX組和43℃組(見表1);檢測(cè)各組HSP70的表達(dá)變化,同時(shí)做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。4.GTSP1在熱療與TAX抑制肺腫瘤細(xì)胞過程中的作用構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.0-GSTP1,轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,熱療聯(lián)合TAX處理轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),照相記錄,噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采

6、用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析,多重比較采用LSD法,構(gòu)成比的比較采用卡方檢驗(yàn),以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：1.熱療與TAX聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肺部細(xì)胞生物學(xué)特性的影響1.1熱療可以減少TAX對(duì)正常細(xì)胞的損傷作用(P<0.05),明顯增強(qiáng)TAX對(duì)肺腫瘤細(xì)胞的抑制作用(P<0.05);1.2熱療造成肺腫瘤細(xì)胞膜損傷,使得大量LDH外漏,所以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LDH發(fā)現(xiàn),43℃+TAX組的LDH較對(duì)照組和

7、TAX組明顯減少(P<0.05);1.3劃痕后24h,對(duì)照組細(xì)胞開始向劃痕區(qū)生長,其余各組劃痕區(qū)中央均未見細(xì)胞生長,且有部分細(xì)胞死亡,TAX組細(xì)胞存活數(shù)目多于43℃+TAX組;劃痕后48h,對(duì)照組細(xì)胞填滿劃痕區(qū),TAX組細(xì)胞部分存活,存在較寬的劃痕區(qū),43℃+TAX組細(xì)胞大多死亡;1.4用Hoechst33342結(jié)合PI染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙染色,在熒光顯微鏡下觀察,呈現(xiàn)低綠色/低紅色的是正常細(xì)胞,高綠色/低紅色的是凋亡細(xì)胞,壞死細(xì)胞則為低綠

8、色/高紅色,對(duì)照組細(xì)胞呈低綠色和低紅色,證明細(xì)胞并未發(fā)生壞死和凋亡,TAX組細(xì)胞則綠色數(shù)量增加,紅色沒有變化,證明已有凋亡發(fā)生,43℃+TAX組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的亮綠色,證明細(xì)胞發(fā)生了明顯的凋亡,而并沒有發(fā)生壞死;1.543℃+TAX組細(xì)胞其DNA條帶出現(xiàn)典型的DNA片段梯帶現(xiàn)象(DNA ladder),而對(duì)照組細(xì)胞未出現(xiàn)DNA梯狀條帶,TAX組細(xì)胞的DNA梯狀條帶不明顯,說明熱療可以誘導(dǎo)肺腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。2.細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)傳導(dǎo)通路在熱療

9、與TAX抑制肺腫瘤細(xì)胞過程中的作用及其相互關(guān)系2.1 ROS產(chǎn)生水平的變化熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS,證明熱療可以明顯提高細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)(P<0.05),ROS的增多可以改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平,損傷細(xì)胞膜,作為信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)傳遞,引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一系列變化。2.2 MKK4表達(dá)和p-JNK水平的變化43℃+TAX組的JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活,產(chǎn)生的MKK4和p-JNK高于對(duì)照組和TAX組(P<0.05),SP600125組的p

10、-JNK水平被抑制(P<0.05),wortmannin組二者表達(dá)均未見明顯變化(P>0.05),NAC組二者的水平均低于43℃+TAX組(P<0.05),說明熱療過程中產(chǎn)生的ROS可以激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。2.3 p-Akt水平的變化43℃+TAX組的Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制,p-Akt的水平低于對(duì)照組和TAX組(P<0.05),wortmannin組的p-Akt水平完全被抑制(P<0.05),SP600125組的p-Akt水平低于

11、43℃+TAX組(P<0.05),NAC組的p-Akt水平明顯高于43℃+TAX組(P<0.05),說明熱療過程中產(chǎn)生的ROS可以抑制Akt通路的活化,同時(shí),JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活影響Akt通路的活化。2.4 Caspase-3表達(dá)水平的變化43℃+TAX組的Caspase-3表達(dá)水平高于對(duì)照組和TAX組(P<0.05),SP600125組的Caspase-3表達(dá)水平低于43℃+TAX組(P<0.05),wortmannin組的Cas

12、pase-3表達(dá)水平高于43℃+TAX組(P<0.05),NAC組的Caspase-3表達(dá)水平完全被抑制(P<0.05),說明熱療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是ROS通過JNK和Akt2條通路傳給caspase途徑而引發(fā)的,且ROS、JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)caspase有活化作用,Akt通路對(duì)其有抑制作用。2.5細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的變化43℃+TAX組G0/G1期和G2/M期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少(P<0.05),wortmannin組S期細(xì)胞更少(

13、P<0.05),SP600125組和NAC組S期細(xì)胞數(shù)目增加(P<0.05),G2/M期細(xì)胞減少(P<0.05);43℃+TAX組細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05),wortmannin組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加(P<0.05),而SP600125組和NAC組細(xì)胞凋亡率減少(P<0.05)。3.HSP70在熱療與TAX抑制肺腫瘤細(xì)胞作用中的地位對(duì)照組和TAX組的HSP70表達(dá)水平幾乎一致(P>0.05),43℃組和43℃+TAX組的HSP70表

14、達(dá)水平均較前兩組增加(P<0.05),且43℃+TAX組的HSP70表達(dá)水平低于43℃組(P<0.05),說明熱療誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70,對(duì)不同性質(zhì)的細(xì)胞產(chǎn)生不同的效應(yīng),熱療聯(lián)合TAX可能激活和/或抑制其他通路的激活,減弱了HSP70對(duì)肺腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用,但這個(gè)現(xiàn)象在正常細(xì)胞中沒有觀察到。4.GTSP1在熱療與TAX抑制肺腫瘤細(xì)胞過程中的作用成功構(gòu)建pcDNA3.0-GSTP1真核表達(dá)載體后,轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,獲得轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的兩種A5

15、49細(xì)胞,MTT結(jié)果示,GSTP1本身對(duì)細(xì)胞生長沒有影響,轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖率一致(P>0.05),GSTP1能促進(jìn)化療藥物的代謝,不同濃度TAX作用后,未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率低于轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(P<0.05),43℃熱療聯(lián)合不同濃度TAX作用后,未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率高于轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(P<0.05);43℃熱療聯(lián)合TAX作用于轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),G0/G1期和G2/M期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少(P<0.05)。
　　結(jié)論及創(chuàng)

16、新點(diǎn)：1.在熱療的作用機(jī)制研究中,首次使用人呼吸道上皮BEAS-2B細(xì)胞作為研究對(duì)象,證明熱療可以減少化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的損傷作用;熱化療聯(lián)合應(yīng)用可以明顯增加化療藥物對(duì)肺腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用,損傷肺腫瘤細(xì)胞膜,抑制肺腫瘤細(xì)胞的遷移,誘導(dǎo)肺腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生;2.通過使用通路抑制劑證明,熱療可以誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,繼而激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和抑制Akt通路的活化,通過caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,熱療主要作用于肺腫瘤細(xì)胞的S期,并

17、可使肺腫瘤細(xì)胞阻滯于G2/M期,從而促進(jìn)TAX對(duì)肺腫瘤細(xì)胞的抑制作用,同時(shí)發(fā)現(xiàn),在熱療中,JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可以調(diào)節(jié)Akt通路的活化狀態(tài),以上結(jié)論在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí);3.熱療誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70,對(duì)不同性質(zhì)的細(xì)胞產(chǎn)生不同的效應(yīng),熱化聯(lián)合的協(xié)同作用可能激活和/或抑制其他通路的激活,減弱了HSP70對(duì)肺腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用,因此比熱療能更好地抑制肺腫瘤細(xì)胞的生長,但在正常細(xì)胞中尚未觀察到這個(gè)現(xiàn)象;4.首次構(gòu)建了pcDNA3.0-GST