五味子多糖的結(jié)構(gòu)、生物活性及免疫機制研究.pdf

1、五味子為木蘭科五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill)的干燥成熟果實，具有食用和藥用價值，已有2000多年的應(yīng)用歷史，列入可用于保健食品的物品名單。五味子中含有木脂素、多糖、揮發(fā)油等多種活性成分，其中木脂素已得到廣泛應(yīng)用，而多糖未被利用。研究發(fā)現(xiàn)，多糖作為一類天然大分子化合物，具有多種生物活性，如機體免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老等，且對機體正常細(xì)胞和組織的毒性極小，因此，已成為天然產(chǎn)物研究的熱點之一。目前

2、，已有多種多糖作為保健食品和食品添加劑、廣譜的免疫促進劑和腫瘤綜合治療中的輔助藥物得到了廣泛的應(yīng)用。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，五味子粗多糖具有免疫調(diào)節(jié)，對環(huán)磷酰胺(CTX)減毒和抗腫瘤等作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。但目前關(guān)于五味子多糖的研究多集中于粗多糖，而對于五味子多糖組分結(jié)構(gòu)的全面深入研究、免疫調(diào)節(jié)作用、對5-Fu減毒作用、抗腫瘤作用及其免疫機制等方面都鮮有報道。因此，本文以一種低分子量五味子多糖為研究對象，運用現(xiàn)代分析方法(GC-MS

3、，NMR，TEM，AFM，CD等)對該多糖組分的結(jié)構(gòu)進行全面分析;通過免疫抑制小鼠模型，對該組分多糖的免疫調(diào)節(jié)作用進行研究，發(fā)現(xiàn)其對機體有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，同時前期研究結(jié)果表明該多糖組分對腫瘤細(xì)胞無直接殺傷作用，因此進一步研究其對5-Fu減毒作用和體內(nèi)抗肝癌活性;通過活性研究結(jié)果，推測該多糖組分主要是通過調(diào)節(jié)機體免疫來發(fā)揮其生物活性的，由此進一步探討其免疫調(diào)節(jié)的機制。本研究揭示該五味子多糖組分的結(jié)構(gòu)特征，并闡明其免疫調(diào)節(jié)機制，為五味子

4、多糖功效成分的研究與應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為五味子多糖類保健食品和食品添加劑的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，并為五味子資源的高效利用提供新途徑，該研究對人類健康和社會經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。
　　 主要研究內(nèi)容如下:
　　 (1)以低分子量五味子多糖組分(SCPP11)為研究對象，通過甲基化、GC-MS、1HNMR、13CNMR、1H-1HCOSY譜、HSQC譜及HMBC譜等化學(xué)分析手段和物理技術(shù)對SCPP11的一級化學(xué)結(jié)構(gòu)進行推斷和

5、解析，確定了低分子量五味子多糖組分SCPP11的一級結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元為:→4)-a-D-Glcp(1}4→｛6)-a-D-Galp(1}2→6)-β-D-Manp(1→4)-β-D-Galp(1→{4)-a-D-Glcp(1}4→β-D-Glcp(1→4)-a-D-Glcp(1→4采用CD、AFM、TEM和SEM等方法對SCPP11的構(gòu)象和分子形貌進行研究。發(fā)現(xiàn)在不同的外界條件下（處理溫度、pH值、加入Ca2+離子、6mol/L的變性劑U

6、rea和等量的80μM的剛果紅溶液），SCPP11的CD譜圖發(fā)生顯著變化，表明外界條件的改變可影響其立體構(gòu)象和非對稱性。用激光光散射粒度儀測定了SCPP11的粒度，結(jié)果表明SCPP11的粒徑為270nm，分散度為0.129，粒度分布較均勻。通過多角度激光光散射得到SCPP11的絕對重均分子量為1.793×104g/mol，多分散系數(shù)為1.543，且其構(gòu)型介于球形和隨機線團之間。通過原子力顯微鏡觀察SCPP11分子的形貌，結(jié)果表明SCPP

7、11分子間相互纏繞，呈規(guī)則團聚狀;經(jīng)加熱處理后，SCPP11高度團聚狀結(jié)構(gòu)大量減少，鏈延展開來。通過TEM觀察SCPP11的形貌，發(fā)現(xiàn)其呈團聚狀態(tài)，粒子的直徑在幾百納米不等。SCPP11粉未呈粗糙的小片狀聚集體，表面緊密，規(guī)整性不強，說明SCPP11固體為無定型結(jié)構(gòu)。
　　 (2)采用CTX抑制小鼠模型，考察SCPP11對小鼠免疫的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，SCPP11對CTX造成的體重增長抑制有較好的改善作用，可不同程度提高胸腺指數(shù)

8、和脾臟指數(shù)，顯著提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力和血清溶血素水平，且對CTX致血清中免疫球蛋白水平、TNF-α和IL-2水平下降有不同程度的恢復(fù)作用。因此，SCPP11對可激活機體免疫，具有免疫調(diào)節(jié)功能。
　　 (3)采用Heps荷瘤小鼠模型，考察SCPP11對化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)的減毒作用和其體內(nèi)抗肝癌活性。結(jié)果表明，與5-Fu組相比，SCPP11可對抗5-Fu所致的小鼠白細(xì)胞減少和免疫器官指數(shù)減小，且對5-

9、Fu所致的機體TNF-α和IL-2水平降低具有較好的恢復(fù)作用，此外SCPP11對5-Fu所致的肝損傷有一定的保護作用?？梢姡琒CPP11對5-Fu具有較好的減毒作用;體內(nèi)抗肝癌結(jié)果表明，在劑量為50mg/kg時，SCPP11可顯著抑制腫瘤的增長，腫瘤抑制率達(dá)到68.54％;SCPP11可顯著提高胸腺指數(shù)和小鼠血清中IL-2和TNF-α水平;且其對小鼠體重、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和心臟指數(shù)無顯著影響，可提高荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞的數(shù)量，使荷瘤小

10、鼠血清AST水平恢復(fù)正常;同時提高小鼠肝臟的SOD活力，降低MDA水平。可見，SCPP11具有較好的抗腫瘤活性，且對機體無毒。SCPPI1主要通過調(diào)節(jié)機體免疫來抑制腫瘤的增長。(4)以腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究對象，考察SCPP11對腹腔巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和作用機制。MTT實驗結(jié)果表明，SCPP11濃度高達(dá)1mg/mL，SCPPI1對RAW264.7細(xì)胞沒有明顯的毒性作用;經(jīng)SCPP11刺激的RAW264.7細(xì)胞和其上清液均可顯

11、著抑制HepG-2細(xì)胞的增殖;SCP11可顯著提高RAW264.7細(xì)胞中性紅吞噬活力和分泌NO，TNF-α和IL-1β的水平;通過westernblot法和RT-PCR法研究發(fā)現(xiàn)SCPP11可顯著上調(diào)iNO蛋白和mRNA的表達(dá)，上調(diào)TNF-αmRNA表達(dá)，進一步證實SCPP11直接影響蛋白質(zhì)代謝和基因表達(dá);TLR4/TLR-2/CR3抗體阻斷實驗結(jié)果表明，抗TLR4抗體可顯著阻斷SCPP11刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO和TNF-α的