植物核小體組裝蛋白1(NAP1)家族成員的功能鑒定.pdf

1、真核生物基因組以高度折疊的染色質(zhì)(Chromatin)形式貯存于細胞核內(nèi)。染色質(zhì)的基本結(jié)構和功能單位是核小體(Nucleosome)，其核心部分由大約146-147bp的DNA圍繞著由各兩個分子的H2A，H2B，H3和H4構成的組蛋白八聚體組成。核小體的正確組裝對于重建有功能的染色質(zhì)結(jié)構十分重要，影響著包括DNA復制，修復，重組，轉(zhuǎn)錄，細胞增殖與分化以及個體發(fā)育等諸多生物過程。核小體組裝需要組蛋白分子伴侶的參與，組蛋白分子伴侶不僅影響著

2、染色質(zhì)的結(jié)構形成及動態(tài)調(diào)節(jié)，而且參與到組蛋白的儲存，核質(zhì)運輸以及組蛋白在染色質(zhì)組裝過程中的摻入和替換。
　　 NAP1(Nucleosome Assembly Protein1)是目前被確認的在各物種(酵母，動物和植物)中都保守存在的組蛋白H2A-H2B分子伴侶。通過去除/替換染色質(zhì)上的組蛋白H2A/H2B，或者通過調(diào)節(jié)核小體的滑動，NAP1可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構及調(diào)節(jié)染色質(zhì)的代謝，進而影響細胞分化和個體發(fā)育等過程。果蠅和老鼠中的

3、遺傳學研究結(jié)果表明一個NAP1同源基因的缺失會導致胚胎致死，說明了NAP1蛋白在胚胎發(fā)育中的重要功能。NAP1蛋白在植物中也是高度保守的，而目前有關植物NAP1蛋白的結(jié)構和功能研究還處于起步階段。我的博士論文主要利用分子生物學、生物化學、細胞生物學以及遺傳學等研究手段分析了高等植物NAP1家族成員的功能及其對植物生長發(fā)育的影響。
　　 我博士論文的第一部分工作主要對水稻和煙草NAP1家族成員進行了分子和生化分析。我們實驗室利用篩

4、選cDNA文庫的方法，分離到3個水稻NAP1基因和4個煙草NAPI基因(Dong et al.，2003.Planta216，561-570)。我們證明了煙草NAP1蛋白可以結(jié)合組蛋白H2A-H2B，我們的結(jié)果支持了NAP1作為H2A-H2B分子伴侶的模式在植物中也是保守的。對NAP1的結(jié)合蛋白的分析表明煙草NAP1蛋白可以和微管蛋白及有絲分裂細胞周期蛋白Nicta；CYCB1；1結(jié)合，暗示其在微管動力學調(diào)控上的潛在功能。利用綠色熒光蛋

5、白作為標記，我進一步研究了水稻和煙草NAP1家族成員的亞細胞定位。核定位輸出抑制劑LMB處理以及核定位輸出信號突變實驗表明Orysa；NAP1；1和Nicta；NAP1；1可以在細胞質(zhì)和細胞核中穿梭。比較有趣的是，其它三個煙草NAP1蛋白以及Orysa；NAP1；2只定位于細胞質(zhì)中，而且并不具有核、質(zhì)穿梭能力。此外，Orysa；NAP1；3缺少典型的核定位信號，但卻在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布。我們還發(fā)現(xiàn)只有Orysa；NAP1；3可以在

6、體外被酪蛋白激酶2(CK2，Casein kinase2)磷酸化。然而，通過點突變分析，我們卻發(fā)現(xiàn)Orysa；NAP1；3的磷酸化并不影響該蛋白的亞細胞定位。以上結(jié)果已發(fā)表于Plant Physiology雜志。
　　 由于擬南芥作為模式植物在遺傳分析上具有巨大的優(yōu)勢，我們轉(zhuǎn)而利用擬南芥系統(tǒng)對NAP1家族蛋白進行功能研究。擬南芥編碼4個NAP1基因，我們發(fā)現(xiàn)其中一個基因(AtNAP1；4)特異表達于雄蕊以及根延長區(qū)的部分，而其它

7、三個NAP1基因則全局表達。更進一步，我們發(fā)現(xiàn)擬南芥NAP1蛋白可以形成同源和異源二聚體，同時他們也可以結(jié)合植物的組蛋白H2A和H2B。在我們實驗室的標準生長條件下，三個全局表達的NAP1基因的缺失的兩個三突變(Atnap1；1-1Atnap1；2-1Atnap1；3-1和Atnap1；1-1Atnap1；2-1Atnap1；3-2)未表現(xiàn)出任何明顯表型。而通過各種DNA損傷試劑的處理，我們發(fā)現(xiàn)這兩個三突變表現(xiàn)出中等強度的紫外(UV-C

8、)敏感以及體外修復DNA損傷的能力降低。兩個三突變的轉(zhuǎn)錄譜和染色質(zhì)免疫共沉淀分析表明擬南芥NAP1蛋白可以直接結(jié)合到一些核苷酸剪切修復(NEK，Nucleotide excision repair)途徑基因的啟動子上，并調(diào)節(jié)這些基因的表達。這些結(jié)果提示擬南芥NAP1家族成員蛋白保守地行使組蛋白H2A/H2B分子伴侶的功能，并且參與調(diào)節(jié)核苷酸剪切修復途徑。
　　 有趣的是，三突變的轉(zhuǎn)錄譜還表明，除了核苷酸剪切修復途徑基因外，某些激

9、素和壓力應答相關基因的表達也發(fā)生了改變，提示我們?nèi)パ芯縉AP1蛋白在植物對激素和壓力應答方面的功能。我們發(fā)現(xiàn)三突變Atnap1；1-1Atnap1；2-1Atnap1；3-1表現(xiàn)出對脫落酸(ABA，Abscisic acid)的輕微超敏感。相反，Atnap1；1-1Atnap1；2-1Atnap1；3-2則在苗的生長和氣孔活動方面比較強烈地表現(xiàn)出對脫落酸的不敏感，并導致該三突變植株鹽耐受性的降低。此外，所有含有Atnapl；3-2等位的

10、突變體以及Atnap1；3-2雜合子都表現(xiàn)對脫落酸的脫敏性。更細致的研究表明在所有含有Atnap1；3-2等位的突變體以及Atnap1；3-2雜合子中均存在一個AtNAP1；3的截短蛋白(碳末端34個氨基酸缺失，命名為AtNAP1；3T)。過量表達這個截短蛋白導致植物對脫落酸的脫敏，并導致一些ABA信號轉(zhuǎn)導途徑基因的表達降低，證實該AtNAP1；3T可能通過調(diào)節(jié)這些基因的表達顯性影響擬南芥對脫落酸的反應。
　　 綜上所述，我的博