貝母甲素性別差異藥動學(xué)研究.pdf

1、貝母類藥材在中國、日本、土耳其有著悠久的民間用藥歷史，目前有多種貝成分制劑用于臨床。貝母甲素(peimine)是多種貝母類藥材的主要成分，藥理研究表明其具有優(yōu)良的抗菌、鎮(zhèn)咳、平喘活性。此外，臨床研究發(fā)現(xiàn)浙貝母及其主要成分貝母甲素具有優(yōu)良的逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞多藥耐藥活性，加之其可人工合成，因此具有良好的開發(fā)前景。
　　藥物的藥動學(xué)行為是否存在性別差異，引起了越來越多的關(guān)注。本文對貝母甲素單體在雌、雄大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為進行系統(tǒng)研究，主要

2、工作如下：
　　一、血漿中以澳洲茄胺為內(nèi)標(biāo)的貝母甲素定量方法的建立
　　本文采用液液萃取法對血漿樣品進行預(yù)處理，建立了以澳洲茄胺(solasodine)為內(nèi)標(biāo)的LC-MS-MS梯度洗脫檢測貝母甲素的方法。該方法合乎USFDA關(guān)于生物樣品分析方法的建議要求，回收率高，專屬性強，靈敏度高(最低定量限0.2 ng mL-1, S/N≥10),準(zhǔn)確度、精密度、均可滿足體內(nèi)分析的要求。該方法已成功應(yīng)用于貝母甲素大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的研究。<

3、br>　　二、貝母甲素雌、雄大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究
　　SD大鼠，按照性別分組,每組5只，分別單次灌胃(l，5，25 mg kg-1)和單次靜注(1 mg kg-1)給予貝母甲素，采用LC-MS-MS法測定給藥后不同時間點血漿中貝母甲素濃度，折線法繪制單獨血藥濃度-時間曲線及平均血藥濃度-時間曲線，并探討平均血藥濃度-時間曲線是否反應(yīng)了單獨血藥濃度-時間曲線的情況。采用DAS2.0( Drug And Statistics，中國藥理學(xué)

4、會數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會編制)軟件擬合藥-時曲線，以AIC值為指標(biāo)推斷房室模型，提供統(tǒng)計矩參數(shù)。
　　雌、雄大鼠單次灌胃不同劑量的貝母甲素后，動力學(xué)過程均符合二室開放模型(w=1/c2),單次尾靜脈注射貝母甲素后，雌、雄大鼠體內(nèi)動力學(xué)過程均符合三室開放模型(w=1/c2)。對高、中、低劑量的血藥濃度和AUC是否與劑量呈正比進行了驗證，另對高、中、低灌胃劑量、靜注劑量的t1/2、CL/F、VZ等進行單因素方差分析，結(jié)果顯示貝母甲素在SD

5、大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為呈現(xiàn)表觀線性動力學(xué)過程，有可能經(jīng)歷了非線性的吸收或代謝。灌胃給予貝母甲素后，大鼠體內(nèi)藥動學(xué)行為存在顯著的性別差異，雄鼠的Cmax、 AUC0-t、AUC0-∞顯著高于雌鼠(p<0.05)，但CL/F、VZ顯著低于雌鼠(p<0.05)。貝母甲素在雌、雄大鼠體內(nèi)的絕對生物利用度分別為5.88％，23.26%。這種性別差異可能主要源于性別差異的吸收或代謝，或為二者共同作用的結(jié)果。
　　三、貝母甲素雌、雄大鼠體內(nèi)排泄研

6、究
　　5 mg kg-1灌胃給藥后，LC-S-MS分析測定不同時間段的尿液、糞便中貝母甲素的濃度，繪制累積排泄率(相對于給藥劑量)曲線。結(jié)果顯示，貝母甲素灌胃給藥后，原型藥排泄量很少。SD大鼠單次灌胃貝母甲素后，雌性大鼠尿液、糞便中原藥排泄量分別為給藥量的0.53‰和1.0‰，雄性大鼠尿液、糞便中原藥排泄量為給藥量的15.1‰和3.46‰。以上結(jié)果顯示，貝母甲素在大鼠體內(nèi)原型排泄量很低，證實了貝母甲素在大鼠體內(nèi)經(jīng)歷了廣泛的代謝，

7、藥物以水溶性更強的代謝產(chǎn)物的形式排出體外，原型藥不是主要的排泄形式。
　　四、Caco-2細(xì)胞模型的建立與評價
　　Caco-2細(xì)胞接種在T-25培養(yǎng)瓶中，21 d后，光學(xué)顯微鏡下進行形態(tài)學(xué)觀察。 Caco-2細(xì)胞以1.2×105/ml的密度接種接種于24孔transwell濾膜上，培養(yǎng)21 d,期間測定堿性磷酸酶活性、跨膜電阻、熒光素鈉透過量以檢驗細(xì)胞單層的極化現(xiàn)象和致密程度。Caco-2細(xì)胞單層在生長14 d以后微絨毛、

8、堿性磷酸酶、緊密連接等呈不對稱分布,21 d后跨膜電阻達到480? cm-2, BL側(cè)（Basolateral）堿性磷酸酶活性為AP側(cè)(Apical)的4.6倍，熒光素鈉透過量為5.12μg·h-1·cm-2。Caco-2細(xì)胞單層形態(tài)與小腸上皮細(xì)胞類似,跨膜電阻、標(biāo)志物透過量均達到要求,可以作為研究小腸藥物轉(zhuǎn)運過程的體外模型。
　　五、貝母甲素跨膜轉(zhuǎn)運方式初探
　　以 Caco-2單層細(xì)胞模型研究不同濃度(n=5)貝母甲素

9、AP→BL方向及 BL→AP方向的轉(zhuǎn)運動力學(xué)過程。并考察了pH、溫度、EDTA、典型P-糖蛋白抑制劑（維拉帕米、環(huán)孢素 A）對不同濃度貝母甲素(n=3)雙向轉(zhuǎn)運動力學(xué)、表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficient,Papp)及外排率RE的影響。
　　考慮到取樣補加接收液造成的稀釋效應(yīng)，對濃度進行了校正,并依 USFDA指南的建議以計算表觀滲透系數(shù)：))(1)((0 c trapp V C S d

10、 dP=，其中dc/dt為受側(cè)介質(zhì)藥物濃度與時間曲線的斜率，準(zhǔn)確計算Papp必須要求受測藥物濃度與時間是直線關(guān)系，而非每一個時間點都對應(yīng)著一個Papp。
　　10~200μM濃度范圍內(nèi)貝母甲素吸收轉(zhuǎn)運（AP→BL）的Papp介于6.2~10×10-6 cm s-1。外排率RE>2提示提示主動轉(zhuǎn)運介入了貝母甲素的跨膜過程。pH、溫度、維拉帕米、環(huán)孢素 A對貝母甲素的雙向轉(zhuǎn)運行為有顯著影響，維拉帕米、環(huán)孢素 A顯著降低貝母甲素的外排。