中空纖維細(xì)胞捕獲和液-固微萃取法及其對(duì)姜黃素類(lèi)活性成分的研究.pdf

1、目的：
　　建立中空纖維細(xì)胞捕獲-高效液相色譜法(hollow fibre cell fishing with high performance liquid chromatography，HFCF-HPLC）、中空纖維液/固微萃取-高效液相色譜法（Hollow fibre liquid/solid phase microextraction with HPLC，HFL/SME-HPLC）和磁力攪拌子液/固微萃取-高效液相色譜法（

2、Stirrer-liquid/solid microextraction with HPLC，Stirrer-L/SME-HPLC），并利用這3種方法研究姜黃、郁金、莪術(shù)中姜黃素類(lèi)活性成分，同時(shí)對(duì)HFL/SME和Stirrer-L/SME的萃取機(jī)理進(jìn)行了分析和討論。
　　方法：
　　對(duì)中空纖維內(nèi)壁種植肝癌細(xì)胞HepG-2，卵巢癌細(xì)胞SKOV-3和腎癌細(xì)胞ACHN的生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞種植時(shí)間、甲醇濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響、纖維活性中

3、心或培養(yǎng)液對(duì)篩選結(jié)果的影響、陽(yáng)性和陰性對(duì)照、篩選活性成分保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的重現(xiàn)性等進(jìn)行考察和優(yōu)化。在最佳HFCF-HPLC條件下，將種植3種癌細(xì)胞、填充3種癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞器以及相關(guān)的磷脂酶C受體的中空纖維，結(jié)合HPLC，對(duì)姜黃、郁金、莪術(shù)提取液中的姜黃素類(lèi)化合物進(jìn)行篩選和鑒定，探討姜黃素類(lèi)活性成分在癌細(xì)胞上的結(jié)合部位以及其與作用靶點(diǎn)。對(duì)影響HFL/SME或Stirrer-L/SME偶合HPLC的萃取溶劑、樣品相的pH、鹽濃度、

4、萃取時(shí)間、攪拌速度和樣品相體積等因素進(jìn)行條件優(yōu)化，對(duì)兩種方法的線性范圍等進(jìn)行方法學(xué)考察。在最佳的HFL/SME-HPLC或Stirrer-L/SME-HPLC條件下，以姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素作為模型化合物，利用HFL/SME或Stirrer-L/SME結(jié)合HPLC對(duì)3種中藥中篩選出的姜黃素類(lèi)活性成分進(jìn)行分離、富集和測(cè)定。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：（1）通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間比對(duì)，初步確定篩選出的姜黃素

5、類(lèi)活性成分是姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素；（2）細(xì)胞與活性成分間的結(jié)合能力與化合物在中藥中的含量無(wú)關(guān)，微量姜黃素類(lèi)活性化合物可能有較強(qiáng)的抗癌活性，中藥抗癌機(jī)制有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)；（3）姜黃素類(lèi)活性成分可作用在癌細(xì)胞的膜和器上，可作為磷脂酶C的抑制劑；（4）HFL/SME和Stirrer-L/SME的萃取機(jī)制是纖維壁孔或攪拌子通過(guò)與目標(biāo)分析物形成電荷轉(zhuǎn)移超分子的吸附以及有機(jī)溶劑的萃取的共同作用；（5）HFL/SME和S

6、tirrer-L/SME操作簡(jiǎn)單、快速、富集倍數(shù)高、無(wú)需任何特殊裝備。
　　結(jié)論：
　　HFCF-HPLC與HFL/SME或Stirrer-L/SME結(jié)合可以對(duì)姜黃、郁金、莪術(shù)中微量姜黃素類(lèi)抗癌活性成分、作用靶點(diǎn)及其含量進(jìn)行研究，驗(yàn)證中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，為闡明了中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，建立中藥個(gè)性化的活性成分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)和試驗(yàn)方法。另外HFL/SME和Stirrer-L/SME是兩種簡(jiǎn)單、快速、濃縮倍數(shù)高、環(huán)境