中藥活性成分中空纖維細胞捕獲及漂浮有機液滴凝固液相微萃取分析.pdf

1、本文首次提出一種研究中藥中活性成分群的新方法一中空纖維細胞捕獲偶合高效液相色譜法(hollowfibercellfishingwithhighperformanceliquidchromatography，HFCF-HPLC)。HFCF-HPLC是將孔壁或內(nèi)腔充滿活細胞的中空纖維插入pH7.4的中藥提取液中，在模擬人體吸收和一定的攪拌速度下，中空纖維孔壁或內(nèi)腔的活細胞對中藥提取液中活性成分進行篩選，篩選到的活性成分分子透過中空纖維壁孔并

2、進入腔內(nèi)被細胞捕獲。篩選結(jié)束后，利用一定的溶劑或溶液將與細胞結(jié)合的活性成分解離或洗脫并進行HPLC分析。本文在對空白和細胞中空纖維表面性質(zhì)表征的基礎(chǔ)上，對中空纖維活性中心與目標物的非特異性結(jié)合和HFCF-HPLC方法的重現(xiàn)性進行了研究；利用HFCF-HPLC分別對中藥材五味子提取液中的木脂素類成分群和蛇床子、補骨脂提取液中的香豆素類成分群進行了篩選、捕獲和分析；通過與標準品的色譜保留時間對照，對篩選出與細胞結(jié)合的部分活性成分進行了結(jié)構(gòu)鑒

3、別。HFCF-HPLC(1)避免了由于生物學特征受到影響而引起有效成分篩選和測定的差異；(2)不需制備生物膜固定相和裝柱，細胞用量少，成本低；(3)篩選過程與色譜過程分步進行，可分別滿足生物體內(nèi)自然吸收條件和色譜分離的最佳條件；(4)活性篩選和樣品凈化同時完成，免去了其他中藥活性篩選法所必需的樣品前處理過程。HFCF-HPLC在對中藥五味子中木脂素類成分群和蛇床子、補骨脂提取液中香豆素類成分群篩選、捕獲、分析中得到成功應用，無疑為中藥活

4、性成分的篩選和研究提供一種普適、高效、方便的新方法。
　　 本文通過分析比較漂浮有機液滴凝固液相微萃取(SFODLPME)對上述方法篩選出的木脂素活性成分群萃取前后紫外光譜的改變，提出了超分子有序聚集凝固液相微萃取(SSMOALPME)機理；建立了簡單、快速、靈敏的SSMOALPME高效液相色譜法(HPLC)同時測定中藥五味子中5種低豐度木脂素類化合物含量的方法，并對不同產(chǎn)地五昧子的質(zhì)量進行比較和評價。對漂浮有機液滴凝固液相微萃

5、取的各參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)化后的液相微萃取條件：在10mL的供相溶液中，加入混合工作液或供試品溶液400μL，甲醇300μL，1mol/LHCl500μL,4.27mol/LNaCl2mL。取20μL正十二醇于樣品溶液表面，蓋蓋。在600rpm的轉(zhuǎn)速下萃取40min，此時供相形成白色云霧狀的微乳液。萃取結(jié)束后靜置，并將玻璃瓶放入-20℃的冰箱中冷凍，6min后取出，正十二醇在溶液表面凝固，用小勺將正十二醇固體取出放入小燒杯中，室溫融化后，用

6、50μL甲醇稀釋，取20μL溶液進行HPLC分析。色譜分離條件：EclipseXDB-Cl8柱(5μm，150mm×4.6mmi.d.AgilentTechnologies)，檢測波長為254nm，柱溫35℃，進樣量20μL，流動相甲醇(A)-0.6％（體積）磷酸(B)，用0.45μm微孔濾膜過濾，梯度洗脫程序：0→4.5min,A∶B(v∶v)=70∶30,0.8mL/min;4.5→5min,A∶B(v∶v)=85∶15,1mL/m

7、in;5→13min，A∶B(v∶v)=76∶24，1mL/min。在最佳的SSMOALPME條件下，測得五味子醇甲，五味子酯甲，五味子甲素，五味子乙素，五味子丙素的線性范圍分別為2.48×10-3～6.21、2.27×10-3～28.5、2.31×10-3～28.8、2.27×10-3～5.69、1.05×10-3～5.25μg/mL；檢測限分別為：0.4、0.4、0.4、0.08、0.08ng/mL；日內(nèi)、日間精密度RSD＜9.7％