血必凈抗內(nèi)毒素作用的體外研究.pdf

1、內(nèi)毒素(endotoxin)是存在于革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜上的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)成分。內(nèi)毒素血癥(endotoxemia,ETM)參與了臨床多種疾病的發(fā)生、發(fā)展,如膿毒癥、燒傷、急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、急慢性肝病、重癥胰腺炎等,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致感染性休克(septic shock)、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)及多器官功能障礙(MODS)。
　　 目前認(rèn)為,單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是內(nèi)毒素作用的主要

2、靶細(xì)胞,也是產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受的主要效應(yīng)細(xì)胞。Toll樣受體4(TLR4)在內(nèi)毒素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。而IL-1受體相關(guān)激酶-M(IRAK-M)則是信號(hào)傳導(dǎo)途徑中重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子。
　　 血必凈注射液是由紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸等活血化瘀中藥提取而成。目前國內(nèi)研究報(bào)道,該藥能直接拮抗內(nèi)毒素,減少內(nèi)源性炎性介質(zhì)的失控性釋放,改善微循環(huán),保護(hù)和修復(fù)應(yīng)激狀態(tài)下受損的臟器,有效降低膿毒癥(sepsis)及其他原因所致的MODS的死亡

3、率。
　　 本研究課題旨在通過體外試驗(yàn)客觀評(píng)價(jià)血必凈的“毒、炎”并治的效果。
　　 第一部分血必凈直接中和或拮抗內(nèi)毒素作用的體外研究
　　 目的:了解血必凈體外有無直接中和或拮抗內(nèi)毒素的作用。
　　 方法:將不同濃度的血必凈和標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素混合后進(jìn)行水浴,再利用鱟試驗(yàn)(顯色基質(zhì)法)檢測(cè)混合液中的內(nèi)毒素含量。
　　 結(jié)果:隨著血必凈濃度的增加,與陽性對(duì)照組相比,內(nèi)毒素含量反有上升,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p

4、＞0.05)。而隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng),各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)毒素水平均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),但差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:血必凈體外無直接中和或拮抗內(nèi)毒素的作用。
　　 第二部分血必凈對(duì)內(nèi)毒素刺激的THP.1細(xì)胞的影響
　　 目的:了解血必凈能否阻斷內(nèi)毒素刺激的THP-1細(xì)胞TNF-α的分泌;進(jìn)一步探究可能的作用機(jī)制,是否與阻斷內(nèi)毒素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受有關(guān)。
　　 方法:預(yù)先用不同濃度的血必凈(以1

5、0、25、50mg/ml為濃度梯度)處理THP-1細(xì)胞,對(duì)照組不添加血必凈,作用不同時(shí)間后(分別為4、12、24小時(shí)),再用10ng/ml的內(nèi)毒素刺激THP-1細(xì)胞4小時(shí)。ELISA法測(cè)定上清液中TNF-α水平;抽提各組細(xì)胞總RNA,用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定并比較各組細(xì)胞TLR4和IRAK-M mRNA的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果:(1)在不同濃度血必凈及不同時(shí)間作用下,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TNF-α分泌水平均無明顯變化(p＞0.05)。(2

6、)只有在作用24小時(shí)時(shí),TLR4表達(dá)才隨著血必凈濃度的增加而略有上調(diào),但與對(duì)照組比較差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:而在50mg/ml濃度組,24小時(shí)的TLR4表達(dá)是4小時(shí)的1。547倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。(3)作用4小時(shí)及12小時(shí)時(shí),各濃度血必凈組與對(duì)照組IRAK-M表達(dá)均無明顯差異;但延長(zhǎng)至24小時(shí)后,高濃度(50mg/ml)血必凈組IRAK-M表達(dá)上調(diào),是對(duì)照組的1.349倍(p＜0.05),而低、中濃度組與對(duì)照組之間無明顯差