地中海貧血鐵過載GDF-15基因多態(tài)性及血清糖蛋白糖基化修飾的研究和意義.pdf

1、第—部分、GDF-15基因多態(tài)性與地中海貧血鐵過載發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究
　　背景和目的：GDF-15表達(dá)與地中海貧血鐵過載發(fā)生、發(fā)展及治療等方面有關(guān)，本部分研究GDF-15基因rs1058587，rs1059369和rs4808793單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)在地中海貧血鐵過載患者及健康人群中的基因分布及頻率，探討rs1058587，rs1059369和rs4808793位點(diǎn)基因多態(tài)性與地中海貧血鐵過載遺傳易感性的關(guān)系，從基因水平

2、為地中海貧血鐵過載的發(fā)病機(jī)制及治療等方面研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:收集來自廣西地區(qū)的地中海貧血鐵過載患者122例，無鐵過載患者162例，選取128例健康體檢者作為對照組。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測GDF-15基因rs1058587，rs1059369和rs4808793位點(diǎn)在病例組與對照組的基因分布頻率，用DNA測序法測定對應(yīng)基因序列，以Hardy-Weinberg平衡(HWE)定律檢驗(yàn)

3、納入病例的群體代表性及可比性。SNP等位基因及基因型的分布差異用x2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，SNP多態(tài)性與地中海貧血鐵過載發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系用logistic回歸方法分析。
　　結(jié)果:三組在性別和年齡構(gòu)成上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。經(jīng)HWE定律檢驗(yàn)，rs1059369和rs4808793兩個(gè)位點(diǎn)P值均大于0.05，說明所選的樣本具有群體代表性，而rs1058587位點(diǎn)P值小于0.001，未通過HWE平衡檢驗(yàn)。rs1059369位點(diǎn)三

4、組間的基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;對照組等位基因分布頻率較鐵過載組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），無鐵過載組較對照組及鐵過載組等位基因分布頻率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;鐵過載患者AA及AT基因型頻率較正常組和無鐵過載組顯著增加，地中海貧血鐵過載的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=2.297，95％CI=1.158-3.1014，P=0.002);攜帶A基因型的個(gè)體患鐵過載的風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=2.259，95％CI=1.177-3

5、.031，P=0.003);對顯性模型及隱性模型進(jìn)一步分析，等位基因A攜帶頻率(AA+AT)在對照組、無鐵過載組及鐵過載組逐漸升高，有顯著性差異(P=0.005)，增加鐵過載的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.553，95％CI=1.177-3.031，P=0.003)。rs4808793位點(diǎn)對照組與無鐵過載組及鐵過載組的基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組基因型分布頻率總體無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），對照組等位基因分布頻率較無鐵

6、過載組及鐵過載組總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組等位基因分布頻率總體無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);鐵過載患者CC及CG基因型頻率較正常組和地?zé)o鐵過載組顯著增加，地中海貧血鐵過載的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=1.295，95％CI=0.557-1.631，P=0.005）;攜帶CC基因型的個(gè)體患鐵過載的風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=1.275，95％CI=0.658-1.589，P=0.016）;對顯性模型及隱性模型進(jìn)一步分析，可看到等位基因C

7、攜帶頻率(CC+CG)在對照組、無鐵過載組及鐵過載組逐漸升高，有顯著性差異(P=0.013)，增加鐵過載的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR=1.159，95％CI=0.797-1.359，P=0.553）。
　　結(jié)論: GDF-15基因多態(tài)位點(diǎn)rs1058587存在GG、CG基因型，以CG型為主，而未發(fā)現(xiàn)CC基因型，極有可能是廣西地區(qū)人群的突變型等位基因頻率極低，檢測標(biāo)本量較小，不足以檢測到突變純合子個(gè)體。GDF-15基因多態(tài)位點(diǎn)rs1059369

8、及rs4808793的多態(tài)性與地中海貧血及鐵過載存在一定相關(guān)性，但rs4808793的多態(tài)性與地中海貧血鐵過載相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第二部分、GDF-15 SNP基因型與血清GDF-15、EPO、Hepc及鐵代謝相關(guān)性的研究
　　背景和目的: GDF-15具有調(diào)節(jié)Hepc的作用，是鐵代謝和紅系生成中拘調(diào)節(jié)因子。地中海貧血患者，尤其是重癥患者血清中的GDF-15水平明顯高于正常人群，這表明GDF-15與地中海貧血鐵過載的發(fā)

9、生發(fā)展密切相關(guān)，但GDF-15在地中海貧血鐵過載中的機(jī)制及它對預(yù)后的影響仍不清楚，其循環(huán)水平及其基因型與地中海貧血鐵過載的關(guān)系尚不明確，其與地中海貧血鐵過載病變嚴(yán)重程度的關(guān)系對闡明鐵過載的作用機(jī)制至關(guān)重要。因此本項(xiàng)目研究GDF-15在地中海貧血中的水平、與鐵代謝的相關(guān)性，希望能發(fā)現(xiàn)GDF-15與鐵過載的關(guān)系，為鐵過載的診斷增加檢測指標(biāo)。
　　方法:疾病組:選取2016年8月至2017年2月廣西醫(yī)科大學(xué)血液內(nèi)科受地貧之家就診的284

10、例地中海貧血患者，其中鐵過載組122例，無鐵過載組162例，男123例，女161例，年齡為0-60歲之間，地中海貧血鐵過載入選病例診斷均符合張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第三版及《鐵過載診斷與治療的中國專家共識(shí)》。地中海貧血鐵過載組中依賴性輸血患者68例，非依賴性輸血患者54例，所有病例均來自廣西地區(qū)，排除合并其它類型貧血、感染性疾病、腫瘤、肝臟及骨疾病等病史。對照組:同期廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的健康體檢者128例，男性54例，女74

11、例，均排除貧血、炎癥、腫瘤等病史，納入標(biāo)準(zhǔn):血清鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白水平處于正常參考區(qū)間，常規(guī)檢查正常者。檢測血清中GDF-15、EPO、Hepc、FER、TrF水平并用WB驗(yàn)證。
　　結(jié)果:經(jīng)檢驗(yàn)，對照組、地中海貧血無鐵過載組和地中海貧血鐵過載組的血清Hb、GDF-15、EPO、Hepc、FER、TrF、Hepc/FER均有顯著性差異(P＜0.05)。地中海貧血鐵過載組根據(jù)是否依賴輸血分層分為依賴輸血組和非依賴輸血組，兩組間的血清H

12、b、GDF-15、EPO、Hepc、FER、TrF、Hepc/FER均有顯著性差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。分析GDF-15水平與Hb、EPO、Hepc、FER、TrF等指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)所有研究對象血清中GDF-15水平與EPO、Hepc、FER等水平成分呈正相關(guān)(P＜0.001)，而與Hb、TrF水平、Hepc/FER比值呈負(fù)相關(guān)(P＜0.001)。GDF-15在地中海貧血患者中急劇升高，與GDF-15基因rs105936

13、9和rs4808793位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率的改變無相關(guān)性，與Hb水平呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.地中海貧血患者GDF-15水平隨著Hb水平的降低而升高，提示地中海貧血患者GDF-15水平升高與貧血及缺氧有關(guān);
　　2.地中海貧血患者GDF-15水平急劇升高與GDF-15基因多態(tài)位點(diǎn)rs1059369及rs4808793的多態(tài)性無相關(guān)性;
　　3.較GDF-15、Hepc，Hepc/FER是一個(gè)更準(zhǔn)確更

14、優(yōu)良的診斷鐵過載的檢測指標(biāo)。
　　第三部分、地中海貧血鐵過載血清糖蛋白糖譜差異研究及意義分析
　　背景和目的:鐵過載可以引起多種臟器功能損害，涉及地中海貧血進(jìn)展、療效及預(yù)后。蛋白質(zhì)糖基化修飾是一種常見的翻譯后修飾，在免疫細(xì)胞粘附、信號(hào)傳導(dǎo)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、受體構(gòu)成、細(xì)胞分化發(fā)育及免疫調(diào)控等方面均有重要作用。本部分研究應(yīng)用凝集素集合芯片技術(shù)對地中海貧血鐵過載患者血清樣本進(jìn)行分析，旨在研究其糖蛋白糖譜特征性變化，篩選地中海貧血鐵過載診

15、斷及活動(dòng)分期相關(guān)特征性糖譜標(biāo)志，為進(jìn)一步診療研究提供思路及基礎(chǔ)。
　　方法:實(shí)驗(yàn)主要包含以下步驟:(1)血清低豐度蛋白的收集:等體積混合4組（α地中海貧血鐵過載組、α地中海貧血組無鐵過載組、β地中海貧血鐵過載組和β地中海貧血無鐵過載組）患者血清，使用高豐度蛋白去除柱收集血清低豐度蛋白;(2)將收集的低豐度蛋白經(jīng)除鹽、超濾、測定濃度后處理為待標(biāo)記緩沖液;(3)待測低豐度蛋白CY5標(biāo)記;(4)凝集素芯片的點(diǎn)制及芯片的雜交;(5)芯片掃

16、描、數(shù)據(jù)提取;(6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS16.0，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)采用兩獨(dú)立樣本的均數(shù)t檢驗(yàn)，方差不齊者采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。(7)凝集素印跡技術(shù)檢測AAL、LCA和WGA三種凝集素對血清糖蛋白的親和能力，驗(yàn)證凝集素芯片結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)果：本次研究中4組樣品中共篩選出34種有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的凝集素陽性親和信號(hào)，其中α地中海貧血篩選出19個(gè)差異性凝集素和β地中海貧血篩選出15個(gè)差異性凝集素。α地中海貧血鐵過載組對AAL、L

17、CA、ABL、AMA、MNA-M、DBA、GHA、GSL1、GSL1b4、HAL、GSL2、GNL、PHA-L、PSA、SSA和LAL凝集素的親和力增強(qiáng)，而對RCA60、STL和WGA凝集素的親和力減弱;β地中海貧血鐵過載組對ABL、GSL2、LCA、STL、TL、AMA、PSA的親和作用增強(qiáng)，而對ConA、GNL、NPL、IRA、HAL、HPL、DSA、MAL-Ⅱ的親和力減弱。凝集素印跡技術(shù)證明AAL、LCA和WGA三種凝集素對血清糖