苯并[a]芘暴露生物標(biāo)志物的研究.pdf

1、目的:建立檢測苯并[a]芘(BaP)染毒大鼠血液和組織中BaP代謝產(chǎn)物3-羥基苯并[a]芘(3-OHBaP)、(+)-anti-7，8-二氫二羥基-9，10-環(huán)氧苯并[a]芘(BPDE)-DNA加合物的高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC/FD)。同時研究3-OHBaP在大鼠血液和心、脾、肺、腎、胃、腸、腦、肌肉中的時間-劑量-效應(yīng)關(guān)系，(+)-anti-BPDE-DNA加合物在大鼠血液和肺、腎、腦中的時間-劑量-效應(yīng)關(guān)系，探討二者血液濃

2、度與各組織濃度的相關(guān)性，討論以血液3-OHBaP和(+)-anti-BPDE-DNA加合物作為BaP暴露標(biāo)志物的可行性。
　　 方法:取純度為96％的BaP溶于玉米油中，分別配制成濃度為高(10mg/mL)、中(5mg/mL)、低(0.5mg/mL)劑量的灌胃液待用。雄性SD大鼠224只，體重180-220g，實驗前禁食12h，自由飲水。所有大鼠隨機分成4組，每組56只，每只大鼠灌胃2mL，建立高劑量組（100mg/kg）、中劑

3、量組(50mg/kg)、低劑量組(5mg/kg)和空白對照組(0mg/kg)。于灌胃后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h各時間點取8只大鼠斷頭處死。立即取血，收集到預(yù)先加入抗凝劑的EP管中，輕輕與抗凝劑混勻。血樣分為2個部分，一部分離心取血漿，另一部分留取全血，用以提取全血DNA。同時迅速取出大鼠的心、脾、肺、腎、胃、腸、腦、肌肉等組織置于生理鹽水中，洗凈，濾紙吸干組織表面水份，將各臟器平均分成2份，一份稱取臟器濕重，加4

4、倍生理鹽水勻漿，制成組織勻漿液，另一份裝密封袋。所有血液及組織樣本于-20℃保存，待測。取樣本1mL血漿，加入2mL丙酮，渦旋5min，離心10min，取上層有機相，蒸干。而后加入150μL丙酮，50μL熒光衍生劑碘乙烷和0.1g無水硫酸鈉，90℃水浴10min;取上述大鼠組織勻漿液樣品100μL于離心管中，加入200μL乙腈，渦旋混合1min，離心10min(10000r/min)，取上清液20μL進樣;取上述200μL全血、50mg

5、組織樣品，分別用試劑盒處理提取DNA，提取后的DNA在0.1mol/LHC1、90℃恒溫水浴酸解4h，乙酸乙酯提取(+)-anti-BPDE-DNA加合物水解產(chǎn)物I-1型苯并芘-四醇(BaP-tetrolI-1)，蒸干乙酸乙酯后，200μLDMSO復(fù)溶，取20μL進樣。利用HPLC/FD法在甲醇/水(97/3，pH4.5)，流速0.5mL/min，激發(fā)波長365nm，檢測波長450nm的色譜條件下外標(biāo)法檢測3-OHBaP;在甲醇/水(5

6、5/45，pH7.0)，流速1mL/min，激發(fā)波長245nm，檢測波長395nm的色譜條件下外標(biāo)法檢測BaP-tetrolI-1。SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件分析實驗結(jié)果。探討大鼠血液及組織3-OHBaP及(+)-anti-BPDE-DNA加合物濃度時間-劑量-效應(yīng)關(guān)系、血液濃度與組織濃度的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:HPLC/FD法能準(zhǔn)確、簡便地檢測3-OHBaP及(+)-anti-BPDE-DNA加合物，樣品提取回收率良好，穩(wěn)定性良好;大

7、鼠血液、心、脾、肺、腎、腦、肌肉中3-OHBaP劑量-效應(yīng)關(guān)系良好，血液、肺、腦中(+)-anti-BPDE-DNA加合物劑量-效應(yīng)關(guān)系良好;血液中3-OHBaP濃度與心、脾、肺、腎、腦、肌肉濃度相關(guān)性良好，血液中(+)-anti-BPDE-DNA加合物濃度與肺、腦濃度相關(guān)性良好。
　　 結(jié)論:本文建立了高效、穩(wěn)定的HPLC/FD檢測法，用于染毒大鼠血液及組織中3-OHBaP及(+)-anti-BPDE-DNA加合物的檢測。血液