基于代謝組學的2型糖尿病和環(huán)境污染物暴露生物標志物研究.pdf

1、本論文基于LC-MS技術開展了2型糖尿病和環(huán)境污染物暴露對人體健康影響的代謝組學研究，以及多環(huán)芳烴和苯暴露人群的生物監(jiān)測與評價研究。采用代謝組學分析方法將量化的外源性刺激與內(nèi)源性代謝物的變化結合起來，獲得早期、整體和動態(tài)的生化信息，尋找與2型糖尿病發(fā)生發(fā)展和環(huán)境污染物暴露相關的小分子生物標志物。
　　首先，本研究基于液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)技術建立了血清脂質學分析方法。結合多元統(tǒng)計分析、動態(tài)變化趨勢分析和ROC分析的

2、數(shù)據(jù)挖掘方法，針對不同病理狀態(tài)和發(fā)病階段的2型糖尿病人，開展了非靶向與靶向相結合的血青脂質組學研究，全面考察了脂類代謝物在2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中的變化趨勢，以獲得與2型糖尿病密切相關的脂類生物標志物。發(fā)現(xiàn)與鞘脂、甘油磷脂、甘油酯和固醇酯代謝相關的53個代謝物在2型糖尿病或其高危人群體內(nèi)發(fā)生了顯著性變化，分析這些代謝物水平的變化可能與胰島素抵抗和氧化應激狀態(tài)的改變相關。進一步通過動態(tài)變化趨勢和ROC分析，篩選出13個隨疾病的發(fā)展呈規(guī)律

3、性變化，并對2型糖尿病具有一定診斷能力的潛在生物標志物，這些代謝物有可能成為2型糖尿病的診斷和療效評價的脂類生物標志物。本研究的結果表明，基于LC-MS技術的脂質組學分析方法不僅可以全面揭示2型糖尿病病理過程中脂類代謝物的變化，為其分子機制的研究提供重要的參考信息，同時為更靈敏、可靠的2型糖尿病早期診斷方法的研究提供關鍵依據(jù)。
　　此外，建立了適用于人尿液中多環(huán)芳烴類化合物和苯化合物的10種代謝物的LC-MS/MS定量分析方法;同

4、時開展了焦化工業(yè)污染區(qū)與對照區(qū)人群中多環(huán)芳烴和苯的暴露水平的生物監(jiān)測與代謝組學研究。采用回歸分析方法深入考察了污染物暴露與代謝組之間的劑量-效應關系，旨在從分子水平上全面、系統(tǒng)地評價環(huán)境污染物暴露對人體健康的危害及其潛在的機制，獲得與污染物暴露相關的靈敏、可靠的小分子生物標志物。研究發(fā)現(xiàn)焦化工業(yè)污染區(qū)人群體內(nèi)多環(huán)芳烴和苯暴露水平顯著升高，并導致氨基酸、嘌呤，脂質和葡萄糖醛酸等多種代謝紊亂，與其相關的多個小分子代謝物水平發(fā)生顯著變化。分析

5、認為這些變化與氧化應激有關，提示多環(huán)芳烴和苯暴露可能是通過氧化應激機制使暴露人群癌癥、心肺疾病和糖尿病等疾病的發(fā)病率升高?；貧w分析結果表明，1-羥基菲和CarnitineC12∶2很有可能成為多環(huán)芳烴暴露和相關生物學效應的生物標志物。本研究表明，基于高靈敏、高通量的LC-MS/MS分析方法，采用生物監(jiān)測與代謝組學相結合的研究策略，可以全面揭示環(huán)境污染地區(qū)人群污染物暴露所引起的早期生物學事件，為環(huán)境污染物的毒性機制和相關疾病防控策略的研究

6、提供新的視角。
　　本論文的研究內(nèi)容主要包括以下兩個部分:
　　1.基于LC-MS技術的2型糖尿病血清脂質組學研究
　　血清中的脂類分子具有結構多樣、濃度范圍差異大等特點，而現(xiàn)有的離子化技術各有其局限性，采用單一的離子化技術可能無法獲得全面的脂類代謝物信息。本研究采用正、負離子檢測模式相結合的LC-MS分析方法，系統(tǒng)比較了常用的ESI，APCI和APPI三種離子化方法在反相色譜條件下對6類代表性脂類化合物和血清中脂類代

7、謝物的離子化能力、靈敏度和覆蓋范圍。結果表明，ESI對脂肪酸、甘油酯、鞘脂、甘油磷脂、固醇酯和異戊烯醇酯類化合物均具有良好的離子化能力，則可檢測到血清中絕大多數(shù)脂類代謝物。APPI對膽固醇（酯）類化合物的離子化能力最強;而APCI對各類化合物的離子化能力均低于ESI或APPI; APPI和APCI均不適用于磷脂類化合物的檢測。這些研究為脂類代謝物質譜分析和脂質組學研究中離子化方法的選擇提供了依據(jù)。
　　在上述研究的基礎上，采用正、

8、負離子檢測模式的LC-(±)ESI-MS分析方法，針對健康人群、2型糖尿病、初診患者、確診兩年以上患者的血清樣本開展了非靶向與靶向相結合的脂質組學研究，并借助于多元統(tǒng)計分析方法，發(fā)現(xiàn)并鑒定出44個在初診2型糖尿病患者體內(nèi)發(fā)生顯著變化的脂類代謝物，29個在2型糖尿病高危人群體內(nèi)發(fā)生顯著變化的脂類代謝物。這些代謝主要與鞘脂、甘油磷脂、甘油脂和固醇酯類的代謝相關。進一步考察這些差異代謝物在各組間的動態(tài)變化趨勢和對2型糖尿病的診斷能力，發(fā)現(xiàn)13

9、個差異代謝物對2型糖尿病具有一定的診斷能力并隨著2型糖尿病的發(fā)展呈規(guī)律性變化。這13個脂類代謝物中，有3個代謝物TG(16∶0/18∶1/18∶0)，TG(16∶0/18∶1/22∶6)和CE(18∶2-OH)在2型糖尿病高危人群和初診患者體內(nèi)具有逐漸升高的趨勢;確診兩年以上患者經(jīng)過藥物持續(xù)性治療后，這種升高趨勢有所降低并趨于正常。其余10個代謝物:C16神經(jīng)鞘氨醇(C16sphingosine)，C16二氫神經(jīng)鞘氨醇(C16 sphi

10、nganine)，植物鞘氨醇(Phytosphingosine)，二氫神經(jīng)鞘氨醇(Sphinganine)，SM(d18∶1/24∶1)，SM(d18∶2/24∶1), LysoPC(18∶0), LysoPC(18∶1), PC(18∶0/18∶0)和TG(16∶0/16∶0/18∶0)在2型糖尿病高危人群和初診患者體內(nèi)具有逐漸降低的趨勢;確診兩年以上患者經(jīng)過藥物持續(xù)性治療后，除LysoPC(18∶0)外，其余代謝物的降低趨勢均有所緩

11、解并趨向正常。上述結果提示，這些差異代謝物有望成為監(jiān)測2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程及相關藥物治療效果的生物標志物。
　　2.多環(huán)芳烴和苯暴露人群的生物監(jiān)測與代謝組學研究
　　為了考察和評價普通人群體內(nèi)多環(huán)芳烴和苯的暴露水平，本研究建立了測定人尿液中苯的代謝物苯巰基尿酸和9種多環(huán)芳烴單羥基代謝物1-OHN，2-OHN，2-OHF,1-OHPH,2-OHPH,3-OHPH,4-OHPH,1-OHP和6-OHC的LC-MS/MS定量分

12、析方法。方法學考察表明，該方法在設定的濃度范圍內(nèi)線性關系良好，準確度和精密度良好，適用于普通人群中苯和多環(huán)芳烴暴露水平的高通量分析和大規(guī)模篩查。采用該方法系統(tǒng)分析了多環(huán)芳烴和苯的10種代謝物在焦化工業(yè)污染區(qū)和非污染地區(qū)238例老年非吸煙者、114例老年吸煙者和214例兒童尿液中的濃度水平。結果表明，污染區(qū)兒童，老年非吸煙者和吸煙者體內(nèi)的多環(huán)芳烴和苯的暴露水平均高于相對應的對照區(qū)人群。污染區(qū)兒童、老年非吸煙者和老年吸煙者體內(nèi)1-OHP的平

13、均濃度水平分別為1.96，1.42，3.13μg/g肌酐，SPMA的平均濃度水平分別為0.68，0.49，3.04μg/g肌酐。本研究全面評價了污染區(qū)與對照區(qū)人群中苯和多環(huán)芳烴的暴露情況，為普通人群污染物暴露健康風險評價提供了重要依據(jù)。
　　為了進一步評價多環(huán)芳烴和苯暴露所引起的早期生物學效應，采用基于LC-MS技術的代謝組學方法對上述人群的尿液樣本進行了分析。結果發(fā)現(xiàn)多環(huán)芳烴和苯暴露水平的升高導致污染區(qū)人群尿液中多種內(nèi)源性代謝物

14、發(fā)生了顯著變化，其中鑒定出18個差異代謝物結構。這些差異代謝物與氨基酸、嘌呤、脂質和葡萄糖醛酸代謝有關。本研究表明，多環(huán)芳烴和苯暴露引起的代謝組變化與氧化應激有關，即多環(huán)芳烴和苯暴露水平的增加及其在體內(nèi)的代謝活化可引起體內(nèi)氧化應激水平的升高進而導致抗氧化劑水平的降低，肌肉蛋白的降解加速，脂質過氧化水平的升高，線粒體功能的異常和Ⅱ相代謝酶表達的增加等廣泛的生物學效應。
　　在上述結果基礎上，為了獲得人群中多環(huán)芳烴及苯暴露與代謝組之間