基于代謝組學(xué)策略的CKD-MBD相關(guān)生物標志物篩選及骨代謝毒性機制研究.pdf

1、慢性腎臟病礦物質(zhì)骨代謝異常(CKD-MBD)是慢性腎功能不全的常見并發(fā)癥，礦物質(zhì)骨代謝異常表現(xiàn)為全身系統(tǒng)性紊亂，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，特別是心血管事件的發(fā)生，極大的縮短了腎病患者的生存時間，增加了腎病患者的死亡率。然而目前的現(xiàn)狀是，骨活檢作為CKD-MBD診斷金標準卻無法普及應(yīng)用，現(xiàn)有的生化指標在疾病診斷方面存在滯后性，不夠靈敏特異，因此尋找新的早期診斷標志物顯得尤為重要;而蛋白結(jié)合類尿毒癥毒素(PBUTs)因腎功能障礙在體內(nèi)蓄積而

2、常規(guī)透析又無法有效清除，且已有很多報道揭示其與CKD-MBD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，PBUTs作為潛在的高靈敏高特異性的生物標志物，目前有關(guān)其在腎病患者體內(nèi)真實水平的評價標準卻相對缺乏，另外PBUTs作為潛在的疾病早期診斷標志物，其在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的毒性作用機制也尚不明確，也限制了治療靶標及新藥的發(fā)現(xiàn)。因此，本論文結(jié)合代謝輪廓分析與代謝靶向分析篩選鑒別礦物質(zhì)骨代謝異常相關(guān)生物標志物，并對代表性的PBUTs進行準確定量，進一步以硫酸對甲酚(P

3、CS)為例，整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)，揭示PBUTs對骨代謝的可能毒性作用機制，主要內(nèi)容如下:
　　1.本研究首先針對CKD-MBD全身系統(tǒng)性功能障礙的三種典型臨床表現(xiàn)進行血清代謝輪廓分析，包括:(1)橫斷面研究:①基于超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜分析繼發(fā)性甲旁亢（高轉(zhuǎn)運骨?。┗颊吲c疾病對照組的代謝輪廓差異，共篩選到32個潛在的血清生物標志物，主要涉及蛋白合成及代謝，氨基酸代謝，能量代謝和甾體激素類代謝等代謝通路，以這些候選的

4、生物標志物構(gòu)建預(yù)測模型對繼發(fā)性甲旁亢的診斷能力進行評估，預(yù)測結(jié)果顯示準確度、靈敏度和特異性分別為71.1％、73.7％和68.4％，預(yù)測效能優(yōu)異;②基于超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜的代謝輪廓分析，比較了嚴重及輕微尿毒癥瘙癢癥(UP)患者的血清代謝輪廓，結(jié)合多元及單變量統(tǒng)計分析方法篩選鑒別了22個與UP相關(guān)的顯著差異代謝物，并經(jīng)逐步回歸分析在22個鑒別的差異代謝物群中篩選到9個差異代謝物聯(lián)合構(gòu)建預(yù)測判別模型，區(qū)分嚴重及輕微尿毒癥瘙癢

5、癥患者時獲得最大受試者工作特征曲線下面積(AUC=0.899)，靈敏度為85.1％，特異性為83.0％，預(yù)測效能優(yōu)異;(2)干預(yù)研究:腎病患者礦物質(zhì)骨代謝異常會引起血液系統(tǒng)功能障礙，腎性貧血是其臨床表現(xiàn)，通過對不同靜脈鐵劑治療響應(yīng)的腎性貧血病人進行代謝輪廓分析，采用液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合多元統(tǒng)計分析鑒別能夠預(yù)測腎性貧血病人靜脈鐵劑治療響應(yīng)的潛在生物標志物油酰胺和抗壞血酸2-硫酸酯，聯(lián)合兩者構(gòu)建預(yù)測模型對靜脈鐵劑治療完全響應(yīng)患者的預(yù)測準確率為87.

6、5％，而對靜脈鐵劑治療完全無響應(yīng)患者的預(yù)測準確率為83.3％。這一預(yù)測模型的受試者工作特征曲線下面積為0.901，證明了油酰胺和抗壞血酸2-硫酸酯作為缺鐵性貧血鐵劑治療響應(yīng)評價指標優(yōu)異的預(yù)測效能。以上研究基于LC-MS技術(shù)對礦物質(zhì)骨代謝異常引起的骨骼系統(tǒng)（繼發(fā)性甲旁亢）、血液系統(tǒng)（腎性貧血）以及皮膚（尿毒癥并發(fā)瘙癢癥）異常分別進行了血清代謝輪廓分析，篩選了CKD-MBD相關(guān)的血清生物標志物，為疾病的早期診斷、早期干預(yù)及治療響應(yīng)預(yù)測提供了

7、新的評價指標。
　　2.接下來，基于前三章代謝輪廓分析結(jié)果與文獻報道PBUTs群體與CKD-MBD相關(guān)的結(jié)論之間的差異，且針對目前缺少腎病患者體內(nèi)PBUTs真實水平評價體系的現(xiàn)狀，我們以目前已報道的PBUTs中代表性的15個（Nδ-羧甲基賴氨酸、戊糖素、犬尿氨酸、喹啉酸、犬尿喹啉酸、對羥基馬尿酸、吲哚-3-乙酸、苯基葡糖醛酸、對甲苯酚葡糖醛酸、硫酸對甲苯酚、馬尿酸、4-乙基苯硫酸、褪黑素、苯乙酸、3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-

8、呋喃丙酸）為分析目標，系統(tǒng)性的考察比較不同的蛋白沉淀試劑及不同類型的固相萃取小柱對血清中15種代表性的PBUTs的提取效率，并建立了基于LC-MS/MS在正負離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)測定人血清中15種PBUTs的定量方法，定量方法通過方法學(xué)驗證后對尿毒癥患者群體及健康人群體內(nèi)的PBUTs真實水平進行準確測定。我們的結(jié)果表明在所有前處理考察方案中，安捷倫的96孔除蛋白磷脂板孔內(nèi)甲醇沉淀方法能提高血清中PBUTs的絕對響應(yīng)，可應(yīng)

9、用于血清中尿毒癥毒素定量分析時的前處理，定量測定結(jié)果表明與健康對照組相比，尿毒癥患者的血清中15種PBUTs濃度顯著升高，本研究為CKD-MBD代謝組學(xué)研究提供了一種新的樣本前處理方法，而所構(gòu)建的代表性的15個PBUTs的定量方法也擴展了我們對尿毒癥群體血清中PBUTs真實水平的認識，我們的定量測定結(jié)果也表明了除PCS和IS之外的其他PBUTs的異常濃度與其可能的毒性作用。本研究聚焦PBUTs群體，優(yōu)化樣品前處理，建立PBUTs的定量方

10、法，為揭示腎病患者體內(nèi)PBUTs的真實水平提供了平臺。
　　3.通過上述代謝靶向分析證明了PBUTs與CKD-MBD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，接下來，以PBUTs代表性成員PCS為示例，MC3T3-E1成骨細胞為研究對象，采用基于UHPLC-QTOF/MS技術(shù)的細胞代謝組學(xué)共鑒別PCS處理后成骨細胞中顯著改變的74個代謝小分子，并采用代謝通路智能分析聚焦了代謝層面15個顯著改變的代謝通路;采用基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法共鑒別PCS

11、處理后成骨細胞中3679個差異表達基因，并通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路顯著性分析聚焦轉(zhuǎn)錄層面顯著改變的58條代謝通路，進一步聚焦代謝水平與轉(zhuǎn)錄水平顯著差異代謝通路，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽代謝和甘油磷脂代謝兩條信號通路在PCS處理后的成骨細胞中代謝水平和轉(zhuǎn)錄水平兩個層面均顯著改變，另外，基于IPA軟件對導(dǎo)入的差異代謝物與差異表達基因數(shù)據(jù)富集分析PCS刺激導(dǎo)致的細胞生物學(xué)功能異常，結(jié)果表明PCS刺激后細胞凋亡功能上調(diào)，而細胞周期，DNA復(fù)制、重組與修復(fù)功能下調(diào)，

12、這些富集的功能異常也與前期細胞活性，細胞凋亡與細胞周期測定結(jié)果一致。本研究為尿毒癥毒素的骨代謝毒性作用機制研究提供了新的思路。
　　本課題通過代謝輪廓分析結(jié)合代謝靶向分析、代謝組學(xué)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析等多角度并聯(lián)合各種生物信息學(xué)策略，篩選了CKD-MBD早期診斷、療效評價的生物標志物，并聚焦蛋白結(jié)合類尿毒癥毒素，建立尿毒癥毒素體內(nèi)真實含量的評價標準;同時進一步結(jié)合上游基因調(diào)控與下游功能分子響應(yīng)多層次探討了尿毒癥毒素對骨代謝的可能毒性作