核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（MAR）調(diào)控的胰島素樣生長因子-1表達(dá)載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化甘藍(lán)的研究.pdf

1、本項(xiàng)目根據(jù)甘藍(lán)(Brassica oleracea var.capitata L.)基因密碼偏愛性,對(duì)IGF-1基因DNA序列進(jìn)行了修改,根據(jù)優(yōu)化的序列,人工半合成了該基因.同時(shí)從煙草(Nicotiana tabacum L.)和甘藍(lán)中各克隆了一段MAR分子,通過轉(zhuǎn)基因測(cè)定分析,兩段MARs均能顯著提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平,因此,被用于構(gòu)建IGF-1高效植物表達(dá)載體,并首次將IGF-1基因?qū)敫仕{(lán),成功獲得了IGF-1轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)新材料,為將甘

2、藍(lán)開發(fā)成一種具有治療作用的藥用蔬菜開辟了道路.研究工作主要包括以下幾個(gè)方面:1核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(Matrix attachment regions,MARs)的分離核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)是能將染色質(zhì)固定在核基質(zhì)上(即能與核基質(zhì)特異性結(jié)合)的一段DNA序列,長度通常為300~1000 bp,廣泛分布于真核生物基因組中,并將真核基因組在結(jié)構(gòu)和功能上分成相對(duì)獨(dú)立的loop單位.MAR不僅使染色質(zhì)形成了環(huán)形結(jié)構(gòu),還能作為DNA復(fù)制的起點(diǎn),并能調(diào)節(jié)真

3、核細(xì)胞中的基因表達(dá).2 GUS表達(dá)載體的構(gòu)建為了分析和比較不同來源的MARs對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的效果,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了以CaMV 35S為啟動(dòng)子,T-NOS為終止子,攜帶了MAR的和不攜帶MAR的GUS表達(dá)載體.3 GUS轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及活性測(cè)定4胰島素樣生長因子-1基因的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)甘藍(lán)基因同義密碼子相對(duì)使用度(Relative Synonymous Codon Usage,RSCU),選擇高頻使用密碼子,對(duì)IGF-1基因DNA序列進(jìn)行了優(yōu)

4、化.5 IGF-1表達(dá)載體的構(gòu)建通過BamH Ⅰ/Sac Ⅰ酶切及連接,用IGF-1替換掉pBGUS中的GUS基因,得到中間表達(dá)載體pBIGFI.依次將煙草MAR插入pBIGFI表達(dá)框兩側(cè)的EcoR Ⅰ位點(diǎn)和HindⅢ位點(diǎn),單酶切后的載體,連接之前都進(jìn)行去磷酸化處理,以防自連.插入后用PCR方法選抒MARs在表達(dá)框兩側(cè)成同向排列的重組質(zhì)粒,陽性克隆命名為pBMIGFIM1(MAR-P35S-IGF-1-TNOS-MAR).用同樣的方法,

5、順序?qū)⒏仕{(lán)MAR插入質(zhì)粒pBIGFI表達(dá)盒兩翼的HindⅢ位點(diǎn)和EcoR Ⅰ位點(diǎn),選擇MARs方向相同的重組質(zhì)粒,陽性克隆命名為pBMIGFIM2.6甘藍(lán)再生-轉(zhuǎn)化體系的建立為了測(cè)定外植體對(duì)卡那霉素(kanamycin,kan.)敏感性,在篩選出的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中附加不同濃度kan.(1、2.5、5、 7.5、10、15、20mg/L),對(duì)下胚軸外植體進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果5mg/Lkan.即可有效抑制甘藍(lán)下胚軸芽分化,此濃度用作轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)抗性