壇紫菜轉(zhuǎn)鱟素基因研究.pdf

1、本研究對壇紫菜轉(zhuǎn)基因育種涉及的下述三個方面進行了系統(tǒng)研究：壇紫菜轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)；GUS基因在壇紫菜葉狀體體細胞內(nèi)的瞬時表達；鱟素基因轉(zhuǎn)化壇紫菜葉狀體體細胞。研究結(jié)果具體如下。 (1)壇紫菜轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)研究。本研究比較了源自銀口凹螺、朝鮮花冠小月螺及雜色鮑的海藻解壁酶中瓊膠酶、木聚糖酶、纖維素酶的比活力，研究結(jié)果表明，銀口凹螺和朝鮮花冠小月螺較之雜色鮑更適合作為應用于紫菜等紅藻的海藻解壁酶的酶源生物；本研究結(jié)果表明，細胞密度、光

2、照強度、培養(yǎng)液比重對壇紫菜葉狀體體細胞的發(fā)育分化具有顯著影響；本研究結(jié)果表明，體細胞對氯霉素很敏感，表明氯霉素可作為篩選壇紫菜轉(zhuǎn)基因植株的有效選擇壓力。 (2)GUS基因在壇紫菜葉狀體體細胞內(nèi)的瞬時表達研究。以電穿孔法將質(zhì)粒pBI221導入壇紫菜葉狀體體細胞內(nèi)，組織化學檢測結(jié)果表明，電擊培養(yǎng)72h、6d的轉(zhuǎn)化組體細胞內(nèi)GUS基因進行了瞬時表達，表達效率分別為1.1×10-6、1.3×10-6；熒光分光光度檢測表明，電擊培養(yǎng)2d-

3、5d的轉(zhuǎn)化組體細胞的GUS比活力都顯著大于對照組的，表明GUS基因進行了瞬時表達。上述結(jié)果表明，本研究建立的壇紫菜葉狀體體細胞外源基因轉(zhuǎn)化體系是有效的。 (3)鱟素基因轉(zhuǎn)化壇紫菜葉狀體體細胞研究。本研究構(gòu)建了鱟素Ⅰ基因同源重組表達載體，利用電穿孔法將其導入壇紫菜葉狀體體細胞。通過PCR、PCR-Southern雜交、Southern雜交等分子生物學檢測方法對導入后的植株進行檢測，結(jié)果表明鱟素Ⅰ基因已成功整合到基因組內(nèi)。本研究首次

4、將鱟素Ⅰ基因成功轉(zhuǎn)入并整合到壇紫菜體細胞基因組內(nèi)，Northern點雜交檢測結(jié)果進一步表明鱟素Ⅰ基因在RNA水平得以表達。本研究推進了紫菜轉(zhuǎn)基因抗病育種的進展，并為紫菜轉(zhuǎn)基因生物反應器的研究工作提供了可資借鑒的基礎(chǔ)資料。此外，本研究結(jié)果還表明，以壇紫菜18SrDNA的460bp、1200bp的序列分別作為外源基因3'端和5'端同源重組序列，同時以家蠶的MARs序列作為增強表達序列，有利于鱟素Ⅰ基因在壇紫菜葉狀體體細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化、整合、表達