番茄乙烯受體基因LeETR1和LeETR2的分子生物學(xué)研究.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文番茄乙烯受體基因LeETR1和LeETR2的分子生物學(xué)研究姓名：鄭鐵松申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：食品科學(xué)指導(dǎo)教師：何國(guó)慶應(yīng)鐵進(jìn)2001.5.1適分化培養(yǎng)基上附加的激素分別為BA25mg／LIAAl0mg／L、BA20mg／LIAA02mg／L、BA25mg／LIAA04mg／L、BA20mg／LIAA04mg／L、BA25mg／LIAA04mg／L：在最適培養(yǎng)基上它們的芽分化頻率分別為924％、885％、916％、89

2、2％和941％。5外植體尤其是下胚軸外植體的放置方式對(duì)分化頻率有明顯的影響。采用下胚軸作外植體時(shí)，一定要正向放置否則苗再生的頻率會(huì)嚴(yán)重下降。6番茄品種9551，T9253、Estrella、9209和Bl對(duì)卡那霉素(Km)的敏感I性不同。9551、T9253、Estrella和9209在附加25mg／LKm的培養(yǎng)基上其分化即完全受抑制，而抑制番茄B1的再生則需要附加100mg／LKin。7以中間表達(dá)載體pPZPlllA為基礎(chǔ)。以克隆的乙

3、烯受體基因LeETRl和LeETR2的特異序列為目的插入DNA，構(gòu)建了反義表達(dá)載體pPZPEl和pPZPE2。通過(guò)PCR和酶切驗(yàn)證表明LeETRl和LeETR2的反義表達(dá)載體已經(jīng)構(gòu)建成功，并已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。為下一步的番茄轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)。8以79日齡的番茄Bl無(wú)菌苗子葉為外植體，根癌農(nóng)桿菌LBA4404(pPZPEl)、LBA4404(pPZPE2)、EHAl05(pPZPEl)和EHAl05∞PZPE2)為介導(dǎo)。采用葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行

4、了反義LeETRI和反義LeETR2的遺傳轉(zhuǎn)化研究。在篩選壓力為Km100mg／L的分化培養(yǎng)基和篩選壓力為Km50mg／L的生根培養(yǎng)基上，2種反義轉(zhuǎn)基因番茄各獲得了O82％和091％的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗再生頻率：通過(guò)PCR和Soutllemblot的結(jié)果證明已經(jīng)獲得了反義LeETRl和反義LeETR2的轉(zhuǎn)基因番茄植株。親代的轉(zhuǎn)基因番茄目前在溫室中生長(zhǎng)良好。同時(shí)在進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的過(guò)程中我們也對(duì)農(nóng)桿菌的類型、農(nóng)桿菌的浸染方式、共培養(yǎng)及預(yù)培養(yǎng)時(shí)間等多種

5、因素對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響進(jìn)行了研究。證明LBA4404和EHAl05都可有效地進(jìn)行番茄的遺傳轉(zhuǎn)化9對(duì)親代轉(zhuǎn)基因番茄生長(zhǎng)特性的初步研究表明，兩種轉(zhuǎn)化植株都表現(xiàn)出了一定的抗衰老特性，但初步觀察其結(jié)果率低于未轉(zhuǎn)化番茄。轉(zhuǎn)化番茄與對(duì)照相比在生長(zhǎng)特性上的這些差異。預(yù)示著乙烯受體基因LETRI和LETR2與番茄的葉片生長(zhǎng)和果實(shí)發(fā)育過(guò)程相關(guān)，這一結(jié)果與我們前面對(duì)LeETRlmRNA和LeETR2mRNA表達(dá)特性的研究結(jié)果相吻合。提示與誘導(dǎo)型的乙烯受體Le