紫云英苷的酶法合成及其抗氧化活性.pdf

1、紫云英苷，又名山奈酚-3-O-葡萄糖苷或者山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷，是一種存在于多種傳統(tǒng)中草藥中的天然黃酮類化合物。研究表明，紫云英苷具有抗炎、抗氧化、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗過敏和抗肝毒等作用，因此受到廣泛關(guān)注。然而，利用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法從植物中提取紫云英苷需要用到大量的有機(jī)溶劑和原材料，化學(xué)合成法的反應(yīng)條件苛刻、復(fù)雜、副產(chǎn)物多，這些局限性在很大程度上限制了紫云英苷的工業(yè)化生產(chǎn)。利用酶促方法在體外合成藥用化合物具有立體選擇性

2、、綠色、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、簡便等優(yōu)點(diǎn)，可彌補(bǔ)前兩種方法的不足，因而具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景，然而該領(lǐng)域在國內(nèi)尚屬空白。本研究旨在建立一種體外酶促合成紫云英昔的方法，以替代傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法和化學(xué)合成法。
　　首先，參照黃酮類化合物的合成途徑，設(shè)計了一條體外酶促合成紫云英苷的途徑，其中包括糖原磷酸化酶(GP)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(GalU)、黃烷酮-3-羥化酶(F3H)、黃酮醇合酶(FLS1)以及類黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT

3、78 K2)，并將編碼這5種酶的基因克隆至原核表達(dá)載體pET-32a或pGEX-5X-1。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，再利用鎳或谷胱甘肽瓊脂糖凝膠純化可溶性表達(dá)的融合蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色顯示，蛋白的純度達(dá)90％以上。
　　然后，將純化的融合酶蛋白在體外與相應(yīng)底物進(jìn)行反應(yīng)，并利用聚酰胺薄層色譜法和高效液相色譜法分析其酶活，同時利用液質(zhì)聯(lián)用儀對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯

4、示，純化的6種融合酶蛋白GP、GalU、F3H(At)、F3H(Gm)、FLS1和UGT78K2都能將其底物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的產(chǎn)物，比活力分別為59.50 IU/mg,31426.77 IU/mg,309.61 IU/mg,659.21IU/mg,4374.45 IU/mg和271.811U/mg。參照文獻(xiàn)報道的反應(yīng)條件，并經(jīng)過進(jìn)一步優(yōu)化，這5種融合酶蛋白可在同一反應(yīng)體系中將原材料柚皮素和糖原直接轉(zhuǎn)化為紫云英苷，且反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Sephadex

5、LH-20凝膠柱層析和高效液相色譜分離后，最終獲得的紫云英苷純度高達(dá)94.11％。
　　最后，通過超氧陰離子和DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)比較分析酶法合成和天然提取的紫云英苷的抗氧化活性。結(jié)果顯示，用這兩種方法獲得的紫云英苷的抗氧化活性沒有顯著性差異(p＞0.05)。
　　終上所述，本文開發(fā)了一種體外合成紫云英苷的新方法，并對合成的紫云英苷的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，為紫云英苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)手段，對其它黃酮類藥物的開發(fā)和利用