紫云英參與共生固氮的結(jié)瘤素基因的分離與鑒定.pdf

1、通過抑制差減雜交，比較了紫云英接種根與不接種根在轉(zhuǎn)錄水平上的差異，建立了紫云英共生結(jié)瘤過程中的差異表達基因文庫。利用斑點雜交對文庫進行了初步篩選，選取在接種根中的雜交信號強度高于不接種根至少3倍的克隆進行測序分析。57個cDNA克隆的測序結(jié)果表明，17個片段與豆血紅蛋白基因(肋)有著很高的同源性；3個片段分別編碼紫云英天冬酰胺合成酶基因AsASl、AsAS2；7個片段分別與早期結(jié)瘤素基因ENOD2、晚期結(jié)瘤素基因nodulin-26以及

2、來自田菁的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因、羽扇豆的二磷酸核苷酸磷酸酶l基因、推測的辣椒半胱氨酸蛋白酶基因、擬南芥的RNA螺旋酶以及苜蓿的一個BAC克隆mth2-10i23表現(xiàn)出或多或少的相似性；另外，有30個片段沒有找到同源基因。 根據(jù)測序分析結(jié)果，對其中的16個基因進一步做了Virtual Northern blot驗證，雜交結(jié)果顯示，其中14個基因只在接種根中表達，另外兩個，4sD243和slB259在未接種根中也有一定表達，但

3、其雜交信號強度遠低于接種根。運用RACE法獲得了這16個基因的全長cDNA及個別基因的基因組DNA。它們的序列分析表明，11個基因編碼的多肽與半胱氨酸簇蛋白(CCP)家族同源，其序列中均含有信號肽和幾個保守的半胱氨酸殘基；這11個多肽中，AsG257與防御蛋白2家族同源，AsD255的C-端帶有蝎毒素類結(jié)構(gòu)域；基因組DNA序列分析顯示，AsD255中編碼信號肽的外顯子與編碼半胱氨酸簇結(jié)構(gòu)域的外顯子之間被一個內(nèi)含子隔開。另外5個基因中，A

4、sE246和AslB259編碼著兩個不同的脂類轉(zhuǎn)運蛋白家族(LXP)類似物，序列比對顯示，這兩個翻譯序列與已經(jīng)報道的豆科植物來源的LTP同源性較低，而與來自非豆科植物的LTP同源性較高；。4sD243所編碼的20-kD的蛋白質(zhì)與來自細菌Usp家族的結(jié)合ATP的MJ0577型亞家族蛋白高度同源，后者被認為可能具有分子開關(guān)的功能；其余兩個基因，AsG2511和AsliC259，前者沒有發(fā)現(xiàn)明顯的同源序列，后者與來自羽扇豆的結(jié)瘤素基因LIDD

5、4A9有著一定的相似性。 RT-PCR分析表明，除了AsC2411、AslB259和AsD243，其它13個基因均只在接種根中表達，在根瘤發(fā)育過程中，它們開始轉(zhuǎn)錄的時間比紫云英豆血紅蛋白基因(Lb)晚2-4天。AsC2411在所有檢測的未接種根及幼齡的接種根中有一個基本表達，并在根瘤發(fā)育過程中被強烈誘導(dǎo)。AslB259在接種根不同生長時期的表達情況相似于Lb，它在33天齡的未接種根中也有所表達，但轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。與AsE246

6、相比，AslB259的表達較早。AsD243在接種和未接種根中均表達，且在成熟根中的轉(zhuǎn)錄水平遠高于幼根；接種后7天，其表達量顯著增加，這比三6開始表達的時間晚2天。在植物不同組織中的表達分析顯示，除了AsD243，其余15個基因均不在葉片和葉柄中表達，它們在根瘤中的轉(zhuǎn)錄水平都非常高，其中一些在除去根瘤的接種根中也有表達，但表達水平下降。不同于AslB259和其它被檢測基因，AsE246只在根瘤中表達，即使在除去根瘤的接種根中也不轉(zhuǎn)錄。在