超表達(dá)JMT基因?qū)η噍锼厣锖铣傻挠绊?pdf

1、青蒿素是從藥用植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.（又名青蒿）中提取的一種含有過(guò)氧橋基團(tuán)結(jié)構(gòu)的新型倍半萜內(nèi)酯，是治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾的特效藥物。然而，天然青蒿中青蒿素含量很低(0.01％～0.8％，DW)，使得青蒿素供應(yīng)不足，價(jià)格昂貴?；瘜W(xué)合成青蒿素，成本高、毒性大不能應(yīng)用于生產(chǎn)。因而培育高產(chǎn)青蒿素的青蒿是一個(gè)共同追求的目標(biāo)。
　　 植物體內(nèi)存在多條代謝途徑，相互之間存在著作用與影響。茉莉酸甲酯(methyljas

2、monate，MeJA)作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，廣泛存在于植物中，在植物應(yīng)激反應(yīng)和次生代謝調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。外源MeJA能夠誘導(dǎo)不同植物中多種次生代謝產(chǎn)物超量積累。研究表明，用外源MeJA處理包括煙草(Nicotianatabacum)、紅豆杉（Taxusmairei）、莨菪（Scopoliaparviflora）和青蒿等植物均能夠極大提高其次生代謝產(chǎn)物合成能力。但是該方法基本停留在處理植物細(xì)胞或發(fā)根的層面，不適用于噴施大規(guī)模田間種

3、植的藥用植物?；诖?，本研究通過(guò)在分子水平上改造MeJA生物合成途徑，改變MeJA在植物細(xì)胞內(nèi)水平，將外源MeJA誘導(dǎo)青蒿素積累這一現(xiàn)象固化為轉(zhuǎn)基因青蒿的遺傳屬性，以達(dá)到提高青蒿素含量之目的。
　　 茉莉酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶(jasmonicacidcarboxylmethyltransferase，JMT)是MeJA生物合成途徑中最后一個(gè)酶，也是MeJA合成的限速酶，催化茉莉酸(jasmonate，JA)合成MeJA。研究表明，在擬

4、南芥(Arabidopsisthaliana)中過(guò)量表達(dá)JMT基因可以使MeJA的含量提高，同時(shí)可增強(qiáng)對(duì)真菌Botrytiscinerea侵染的耐受性，這與擬南芥中其它次生代謝產(chǎn)物合成能力提高有關(guān)。
　　 本研究采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以根癌農(nóng)桿菌LBA4404(p1304+-AtJMT)介導(dǎo)，采用葉盤法將AtJMT導(dǎo)入青蒿中;并以10mg·L-1的潮霉素(hygromycin，Hygr)進(jìn)行抗性篩選，獲得了抗性芽;35d后待抗性芽長(zhǎng)至

5、2cm左右將其轉(zhuǎn)至MS+0.05mg·L-1萘乙酸(1-naphthylaceticacid，NAA)+400mg·L-1頭孢霉素(cefalexin，cef)+10mg·L-1Hygr培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選培養(yǎng)并生根，抗性芽生長(zhǎng)及生根狀況良好。待除菌完全后對(duì)青蒿進(jìn)行基因組PCR檢測(cè)，在轉(zhuǎn)基因青蒿中能夠檢測(cè)到AtJMT和Hygr基因，而非轉(zhuǎn)基因青蒿不能檢測(cè)到AtJMT和Hygr基因，并以農(nóng)桿菌virD1基因作為對(duì)照以排除農(nóng)桿菌污染。46株抗性

6、苗中獲得6個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化AtJMT的青蒿株系。將已經(jīng)通過(guò)基因組PCR檢測(cè)的陽(yáng)性植株在MS+1mg·L-16-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)+0.1mg·L-1NAA培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁;待芽長(zhǎng)至2cm左右在不含任何激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng);待苗長(zhǎng)至5cm左右時(shí)，將其轉(zhuǎn)到品氏托普基質(zhì)中煉苗，最后移栽到試驗(yàn)田中。收集在田間生長(zhǎng)4個(gè)月的轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因植株葉片，作為后續(xù)分子檢測(cè)及含量檢測(cè)的植物材料。
　　

7、 采用qPCR檢測(cè)目的基因AtJMT在青蒿中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在青蒿中超表達(dá)AtJMT后，不同轉(zhuǎn)基因青蒿株系中AtJMT的表達(dá)情況差異較大。AtJMT表達(dá)量的高低依次為:J61＞J27＞J45＞J5＞J24＞J25，其中J61和J27中AtJMT表達(dá)量較其它株系高得多。
　　 同時(shí)，GC-MS結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)AtJMT基因青蒿中MeJA含量較非轉(zhuǎn)基因也有明顯提高，其中J61株系含量最高，是非轉(zhuǎn)基因的13倍，MeJA含量由2.6

8、73μg·g-1FW提高到35.305μg·g-1FW，MeJA含量的增加趨勢(shì)與AtJMT基因的表達(dá)量結(jié)果基本吻合。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因株系中超表達(dá)AtJMT基因確實(shí)可以促進(jìn)MeJA的合成。
　　 采用HPLC-ELSD檢測(cè)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量，結(jié)果顯示，在所有轉(zhuǎn)基因株系中，青蒿素含量均有提高，J24株系青蒿素含量提高最多，約為野生青蒿的5.8倍，含量從0.901mg·g-1DW提高到5.212mg·g-1DW。
　　

9、 此外，采用qPCR檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素生物合成途徑上11個(gè)相關(guān)基因(包括HMGR、DXS、DXR、HDS、HDR、FPS、ADS、CYP、DBR2、ALDH1、RED1)表達(dá)量。結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因青蒿相比，轉(zhuǎn)基因株系中青蒿素生物合成途徑上的10個(gè)基因(HMGR、DXS、DXR、HDS、HDR、FPS、ADS、CYP、DBR2、ALDH1)的表達(dá)水平有明顯上調(diào);而與青蒿素生物合成途徑的一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)支路上的1個(gè)基因—RED1有

10、下調(diào)的趨勢(shì)。這說(shuō)明，轉(zhuǎn)AtJMT使得內(nèi)源MeJA含量提高，導(dǎo)致青蒿素合成途徑中相關(guān)基因表達(dá)量上升，控制代謝流更多的向青蒿素合成方向轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)青蒿素的積累。
　　 本研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在青蒿中超表達(dá)AtJMT基因，使得青蒿內(nèi)源MeJA生物合成能力增強(qiáng)，內(nèi)源MeJA含量提高;MeJA導(dǎo)致青蒿素生物合成途徑中多個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，從而使得代謝流更多的向青蒿素生物合成方向流動(dòng)，最終表現(xiàn)為青蒿素生物合成能力和含量的提高。轉(zhuǎn)JMT基因青蒿中