1L-17A-Th17促進(jìn)矽塵誘發(fā)自身免疫及1L-17A的中和延緩Th1-Th2極化免疫應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 矽肺是由于在生產(chǎn)過(guò)程中長(zhǎng)期吸入游離二氧化硅含量較高的粉塵（矽塵）而引起的以肺組織纖維化為主的全身性疾病，是最主要的塵肺病類型。矽肺患者常伴發(fā)各種自身免疫性疾病，進(jìn)一步加劇矽肺的發(fā)生發(fā)展。矽肺的發(fā)生發(fā)展是一種慢性炎癥過(guò)程，也是由Th1型向Th2型免疫應(yīng)答極化的過(guò)程。矽塵進(jìn)入肺內(nèi)，激活肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages，AMs)釋放大量的細(xì)胞因子，募集中性粒細(xì)胞至肺組織。此時(shí)T淋巴細(xì)胞分泌IL-2、

2、IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子，肺內(nèi)逐漸形成細(xì)胞性結(jié)節(jié)。矽結(jié)節(jié)經(jīng)歷細(xì)胞性結(jié)節(jié)、纖維細(xì)胞性結(jié)節(jié)、細(xì)胞纖維性結(jié)節(jié)，最終轉(zhuǎn)化為纖維性結(jié)節(jié)過(guò)程中，矽肺逐漸由肺泡炎期過(guò)渡到纖維化期。此時(shí)T淋巴細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等Th2型細(xì)胞因子，調(diào)控纖維母細(xì)胞的分化以及成纖維細(xì)胞的趨化作用、增殖及膠原的合成，同時(shí)抑制Th1型免疫反應(yīng)。Th17(T helpertype17)細(xì)胞是以表達(dá)IL-17A為特征的新CD4+T細(xì)胞亞群，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾

3、病、腫瘤和移植排斥等的發(fā)生和發(fā)展，特別是與機(jī)體自身免疫病的發(fā)生關(guān)系密切。在TGF-β和IL-6的共同作用下，初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，表達(dá)孤核受體（Orphan nuclear receptor，ROR-γt）和IL-23受體(IL-23R)等。IL-23R和IL-23對(duì)Th17細(xì)胞存活、擴(kuò)增和其介導(dǎo)炎癥和自身免疫發(fā)生起重要調(diào)節(jié)作用。IL-1β可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化。IL-17A是Th17細(xì)胞的標(biāo)志性因子，可誘導(dǎo)其它炎癥細(xì)胞因子的表

4、達(dá)，上調(diào)趨化因子和胞質(zhì)金屬蛋白酶，引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷;同時(shí)IL-17A可參與中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化，并能促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞成熟。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人中IL-17A表達(dá)均升高;肺囊性纖維化和慢阻肺的病人IL-17A的表達(dá)較正常對(duì)照組增加。以上結(jié)果提示在矽塵誘發(fā)的自身免疫中Th17型免疫應(yīng)答也可能存在并起重要作用。
　　 為探討IL-17A/Th17在矽肺發(fā)生發(fā)展中誘發(fā)自身免疫的機(jī)制，我們用矽塵建立IL-17A

5、中和小鼠矽肺纖維化模型，確定在矽塵誘發(fā)自身免疫發(fā)生的過(guò)程中Th17數(shù)量和活化特點(diǎn)，分析IL-17A/Th17對(duì)Th1/Th2免疫應(yīng)答建立時(shí)效特征和效應(yīng)差異，旨在為尋求防治疾病新靶點(diǎn)提供新的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、應(yīng)用抗體中和小鼠體內(nèi)的IL-17A
　　 C57BL/6小鼠（6-8w齡，雌性）經(jīng)腹腔注射100μg anti-IL-17A Ab，中和小鼠體內(nèi)IL-17A，建立SiO2抗體組模型。

6、SiO2模型組、對(duì)照組C57BL/6小鼠腹腔注射等體積的IgG1抗體。SiO2抗體組、SiO2模型組、對(duì)照組C57BL/6小鼠分別行暴露式氣管內(nèi)注入法灌注二氧化硅顆粒懸液和生理鹽水。將各組動(dòng)物分別于7，28，56天處死，收集BALF;收集肺門(mén)淋巴結(jié)、脾組織，用于制備細(xì)胞懸液。摘取肺臟，-80℃保存。
　　 二、ELISA檢測(cè)血清中自身抗體水平
　　 ELISA試劑盒測(cè)定小鼠血清中ANA和抗-dsDNA抗體的濃度。測(cè)定前將

7、血清稀釋100倍。每孔分別加入100μl不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品（制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）或稀釋后的樣本，室溫孵育1h，棄去板中液體，PBS清洗四次，加入抗小鼠免疫球蛋白-辣根過(guò)氧化物酶100μl，室溫孵育30min，棄去板中液體，PBS清洗五次，加入底物TMB100μl，室溫避光孵育15min，加入100μl終止液，450nm處讀板。
　　 三、炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù)
　　 將各組動(dòng)物各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的BALF1500rpm，4℃，離心10min

8、，收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，取10μl細(xì)胞懸液置于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)=(四個(gè)大格的細(xì)胞總數(shù)/4)×104。取400μl細(xì)胞懸液，室溫1500rpm離心8min，棄上清，加入200μl小牛血清混勻，推片，室溫晾干，用甲醇固定，37℃溫箱過(guò)夜，用Giemsa染液染色，室溫15min;蒸餾水背沖，晾干。油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞的數(shù)量。
　　 四、流式細(xì)胞技術(shù)
　　 脾和肺門(mén)淋巴結(jié)細(xì)

9、胞懸液細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取0.1ml（106細(xì)胞），應(yīng)用CD4-PerCP-Cy5.5、IL-17A-PE檢測(cè)Th17細(xì)胞。PMA刺激細(xì)胞4-5小時(shí)后，加入離子霉素和莫奈霉素，用rat anti-mouse CD16/CD32封閉FcRs。加入預(yù)冷的固定液，4℃避光孵育30min，3％FBS的PBS清洗細(xì)胞兩次，加入37℃預(yù)熱的破膜液，37℃避光孵育細(xì)胞30min，再次清洗細(xì)胞兩次，應(yīng)用PerCP-Cy5.5標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的IL-

10、17A抗體室溫避光孵育細(xì)胞30min，進(jìn)行胞內(nèi)染色。清洗后，加入1％多聚甲醛的PBS300μl，混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。FACSCanto（II）流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。以FSC、SSC、anti-CD4-PerCP-Cy5.5定義CD4+T細(xì)胞，分析計(jì)算CD4+T細(xì)胞群內(nèi)CD4+IL-17A+細(xì)胞所占的比例。
　　 五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime PCR)
　　 取100mg肺組織，加入1ml Triz

11、ol試劑，冰浴勻漿，12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新管中，室溫靜置5 min;每管加入200μl氯仿，用力震蕩30秒，室溫靜置3min;4℃，12000rpm，離心15 min;吸取上清至新的1.5ml EP管。加入等體積-20℃預(yù)冷的異丙醇0.5ml，混勻后室溫沉淀10 min;4℃，12000rpm離心10 min后，棄上清;加入4℃預(yù)冷的75％乙醇1ml，洗滌沉淀及離心管壁;4℃，7500rpm離心5 min，棄上清

12、;室溫干燥15分鐘;加入30μl RNase-free水，至完全溶解，測(cè)定RNA濃度。應(yīng)用Takara公司逆轉(zhuǎn)錄酶，將2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用ABI7500 Realtime PCR儀定量測(cè)定，相對(duì)定量法計(jì)算各組小鼠目標(biāo)基因IFN-γ、IL-4、 IL-6、 IL-23、 IL-1βmRNA的表達(dá)水平。
　　 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 全部數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示為mean±S.E.

13、M，采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，用SNK法進(jìn)行組間比較，p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、IL-17A的中和抑制SiO2所誘導(dǎo)的Th17型免疫應(yīng)答
　　 染塵后7天，SiO2抗體組脾中CD4+IL-17A+T細(xì)胞顯著少于SiO2模型組。染塵后7天，SiO2模型組肺門(mén)淋巴結(jié)中CD4+IL-17A+T細(xì)胞顯著高于對(duì)照組;染塵后7天，SiO2抗體組肺門(mén)淋巴結(jié)中

14、CD4+IL-17A+T細(xì)胞顯著低于SiO2模型組。IL-17A的中和可降低SiO2顆粒引起的免疫應(yīng)答過(guò)程中Th17細(xì)胞的比例。
　　 Realtime-PCR結(jié)果顯示，染塵后7天，SiO2抗體組IL-6和IL-1β的表達(dá)均低于SiO2模型組。染塵后各時(shí)間點(diǎn)SiO2抗體組和SiO2模型組IL-23的表達(dá)無(wú)顯著性差異。表明IL-17A的中和可抑制Th17細(xì)胞的分化。
　　 二、IL-17A的中和導(dǎo)致SiO2所致的自身免疫應(yīng)

15、答減弱
　　 ELISA檢測(cè)血清中ANA和抗-dsDNA抗體的濃度。染塵后56天，SiO2模型組血清中ANA和抗-dsDNA抗體的濃度均高于對(duì)照組;SiO2抗體組血清中ANA濃度低于SiO2模型組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SiO2抗體組血清中抗-dsDNA抗體的濃度略低于SiO2模型組。結(jié)果表明IL-17A的中和可減輕SiO2所致自身免疫。
　　 三、IL-17A的中和延遲SiO2所致的小鼠肺部炎性細(xì)胞的聚集
　　

16、分類計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，染塵后7天，SiO2抗體組BALF中細(xì)胞總數(shù)顯著低于SiO2模型組。染塵后7天，SiO2抗體組BALF中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均顯著少于SiO2模型組。IL-17A的中和可抑制BALF中炎性細(xì)胞的聚集。
　　 四、IL-17A的中和延緩SiO2誘導(dǎo)的Th1/Th2極化免疫應(yīng)答進(jìn)程
　　 Realtime-PCR檢測(cè)肺組織Th1型(IFN-γ)和Th2型(IL-4)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平。染塵后7天Si

17、O2模型組小鼠肺組織中IFN-γ的表達(dá)明顯升高;28天，56天SiO2模型組IFN-γ的表達(dá)有所下降。染塵后7天SiO2抗體組IFN-γ的表達(dá)較SiO2模型組低，28天SiO2抗體組IFN-γ的表達(dá)顯著高于SiO2模型組和對(duì)照組，56天，SiO2抗體組IFN-γ的表達(dá)高于SiO2模型組。SiO2模型組IL-4的表達(dá)隨時(shí)間逐漸增多。在染塵后56天SiO2模型組IL-4的表達(dá)達(dá)到最高峰，此時(shí)SiO2抗體組IL-4表達(dá)低于SiO2模型組。表明