蠟樣芽孢桿菌超氧化物歧化酶生理功能研究及與細(xì)菌定殖相關(guān)性分析.pdf

1、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文蠟樣芽孢桿菌超氧化物歧化酶生理功能研究及與細(xì)菌定殖相關(guān)性分析姓名：王勇軍申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：王慧敏;王琦20070601A B S T R A C TP l a n t M i c r o 。e c o l o g i c a lS y s t e m i s ac o m p l e x e c o l o g i c a l s y s t e mw h i c h a s p e c

2、 t s a r ei n t e r r e l a t e d ．B a c t e r i u m i st h ev e r yi m p o r t a n tm e m b e r o f t h i ss y s t e m ．F o r m e r l y ，w e h a v ed e v e l o p e d t h e r e s e a r c hi ni s o l a t i n ga n d s c r

3、e e n i n g t h eb a c t e r i ai nt h i ss y s t e m t op r o m o t e t h ep l a n t g r o w t ha n d b i o c o n t r o lt h ed i s e a s e s ，B a c i l l u sc e r e u s 9 0 5 ，i s o l a t e df r o mt h ew h e a t o nt

4、h eb a s eo f t h i ss y s t e m ，s h o w e dt h ee f f e c t i v e f u n c t i o ni np r o m o t i n g t h ec r o p s g r o w t h ，s u c h a sw h e a t a n d r i c e ，a n d b i o c o n t r o l l i n gt h ed i s e a s e

5、si ng r e e n h o u s e a n d f i e l d ．C o l o n i z i n g t h ep l a n t w e l li se s s e n t i a ld u r i n g t h eb a e [ e r i ag i v e p l a y t 0t h e i rp r o f i t a b l ef u n c t i o n ．O u r p r e v i o u s

6、r e s e a r c hs h o w e d t h a t 丑c e r e u s 9 0 5 c o u l dc o l o n i z et h ew h e a t r h i z o s p h e r ew i t hl a r g ep o p u l a t i o ns i z e ．T of u r t h e r a n a l y z et h ec o l o n i z a t i o n m e

7、 c h a n i s m o f t h i ss t r a i n ，w ef o c u s e d o n t h et o x i c i t yo f a c t i v eo x y g e ns p e c i e sa n d t h ef u n c t i o n so f s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( S O D ) ，a k e y e n z y m ei

8、ns c a v e n g i n g t h es u p e r o x i d e a n i o n ，d u r i n gt h ec o l o n i z a t i o n ．H e t e r o g e n e t i c S O D c a n r e s t o r et h eS O D + p h e n o t y p e o f E s c h e r i c h i a c o l iQ C 7 7

9、 9 ，as t r a i nt h a tl a c k s S O D e n z y m e s ．O n t h eb a s i s o f i t ，t w od i s t i n c tc l o n e s h a r b o r i n g t h es o d A - c o n t a i n i n gp l a s m i d s g r e w o nt h eL B p l a t ec o n t a

10、 i n i n g5 0 1 ．t g ／m lp a r a q u a t a f t e rt h ec o s m i d l i b r a r i e so f B ．c e r e u s9 0 5g e n o m i c s w e r et r a n s f e r r e dt oE ．c o l iQ C 7 7 9 ．B o t ho f t h eS O D g e n e s i nt h e p l

11、a s m i d s w e r ei d e n t i f i e da sM n S O D g e n e s a f t e rc h e m i c a li n h i b i t a t i o na s s a y a n d t h e B L A S T a n a l y s eo f t h ep u t a t i v e a m i n o a c i d ss e q u e n c e s ，a n

12、dt e r m e ds o d A - 1a n d s o d A 一2r e s p e c t i v e l y ．T h e S O D a c t i v i t i v e so f t h e i rc o d i n gp e p t i d e sw e r ef u r t h e ri d e n t i f i e da f t e r e x p r e s s i o ni nE c o l iB L

13、2 1 ．A c c o r d i n g t ot h el o w a m i n o a c i d ss e q u e n c e s i m i l a r i t y ( 5 8 ．4 3 ％) b e t w e e nt h e m ，w ed e t e r m i n e dt h ed i s t i n c t i o nb e t w e e n t h e ma n d s u g g e s t e d

14、 t h a tb o t ho f t h e m d i s p l a yt h e i r d i s t i n c ts e p a r a t e e v o l u t i o n ．O b t a i n i n gS O D - - d i f i c i e n t m u t a n t s a n d c o m p a r i n g t h e m w i t hw i l d ·- t y p

15、es t r a i na r en e c e s s a r y t od i s c o v e rt h eS O D s ’p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ．A sa G r a m —p o s i t i v es t r a i n ，t h e r e a r e n 0m u c ht e c h n o l o g i e s t or

16、 e f e ri ng e n e t i c o p e r a t i o no f B ．c e r e u s 9 0 5 ．I nt h i s r e s e a r c h ，w e c o n s t r u c t e d t h et w o - s t e p D N A h o m o g e n o u s r e c o m b i n a n t s y s t e mt ok n o c k o u t

17、t h e g e n e ．D u r i n gt h ec o n s t r u c t i o n ，s e v e r a lm a t e r i a l ss u c h a st h et o o lv e c t o rp E B S ，w e r e f u l f i l l e dt o f i tw i t ht h ek n o c k - o u t p r o c e d u r e sa n d t

18、h et r a n s f o r m a t i o np r o c e d u r e s o r B ．c e r e u s w e r eo p t i m i z e d ．B y u s e o f t h ek n o c k —o u t s y s t e mc o n s t r u c t e d ，3m u t a n t s t r a i n s ，e a c hl a c k i n g e i t

19、h e rs o d A 一1 ，s o d A ·2 o rb o t h ，w e r ec r e a t e dA n a l y s i so f t h e s em u t a n t s t r a i n sr e v e a l e dd i f f e r e n c e s i nt r a n s c r i p t i o na n d e n z y m a t i ca c t i v i t

20、yo f S O D ．M n S O D 2 ，e n c o d e db y s o d A - 2 ，i se x p r e s s e d h i g h e rt h a nM n S O D l ，t h e p r o d u c t o f s o d a 一1g e n e ．T h e s u r p l u sa c t i v eo x y g e n s p e c i e sc a n n o to b