植物內(nèi)生蠟樣芽孢桿菌M22超氧化物歧化酶基因克隆及體外表達(dá)酶活性分析.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文植物內(nèi)生蠟樣芽孢桿菌M22超氧化物歧化酶基因克隆及體外表達(dá)酶活性分析姓名：尚玉磊申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：張炳欣王琦20040501浙江大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要3蠟樣芽孢桿菌M22基因組文庫(kù)的構(gòu)建及鐵超氧化物歧化酶基因片段的克隆以具有抗病、促生作用的植物內(nèi)生蠟樣芽孢桿菌M22為材料，制備其基因組總DNA，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Sau3AI部分酶切后，在TtDNA連接酶作用下與經(jīng)BaaBI完全酶切、去磷酸

2、化的粘粒pZLl連接后進(jìn)行包裝。取少量包裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化叵coliDHSa，從理論上推知該文庫(kù)容量為3l，700pfu／ml。取100)L1包裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)染SOD缺陷型大腸桿菌QC779，篩選能夠在含lOmol／LParaquat的LB平板(含5()Ⅲg／LAⅢp和2()Ⅲg／LKan)上生長(zhǎng)的菌落。經(jīng)酶切驗(yàn)證顯示，重組質(zhì)粒含有約40kb大小的外源片段。將重組菌株的超聲破碎液進(jìn)行活性聚丙烯酰胺凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)在深藍(lán)色背景下有透明的單一活性條帶出現(xiàn)，

3、經(jīng)驗(yàn)證為Fe—SOD。根據(jù)Fe—SOD序列的保守位點(diǎn)合成簡(jiǎn)并引物，以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，結(jié)果擴(kuò)增到長(zhǎng)414bp的基因片段，GenBank登錄號(hào)為AY378171。該片段編碼的138個(gè)氨基酸殘基的肽段同其它種屬Fe—SOD具有很高同源性，且保守氨基酸殘基類型及位置均與其它來(lái)源Fe—SOD相同，可確定擴(kuò)增片段為蠟樣芽胞桿菌Fe—SOD基因核心區(qū)。4蠟樣芽孢桿菌M22銅鋅超氧化物歧化酶基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)根據(jù)已經(jīng)克隆的蠟樣芽孢桿菌

4、CuZn—SOD的基因序列，設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增CuZnSOD的編碼框序列。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶消化后與用同樣酶消化的酵母分泌型表達(dá)載體pPICZdA連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。利用限制性內(nèi)切酶對(duì)在Zeocin平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切鑒定，然后將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子線性化后電激轉(zhuǎn)化酵母GSll5的感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)能夠在Zeocin抗性平板上生長(zhǎng)的菌落利用特異引物和通用引物進(jìn)行PCR鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆，用甲醇誘導(dǎo)陽(yáng)性克隆的外源基因表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲