人類唾液腺組織片新型培養(yǎng)模型的建立.pdf

1、目的:在人類唾液腺體的研究進(jìn)程中，如何在完全體外環(huán)境下維持唾液腺體細(xì)胞的三維（3D）形態(tài)結(jié)構(gòu)一直以來都是個難題。本研究的目的在于建立一個新型的人類唾液腺組織培養(yǎng)模型和并維持組織片在體外環(huán)境下的生理功能，蛋白和基因表達(dá)。通過該模型的建立，使唾液腺組織片能夠在體外環(huán)境下保留組織內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的多樣性，使我們有機(jī)會將該模型運(yùn)用于唾液腺相關(guān)的生理和病理學(xué)研究中，從而探討人類唾液腺體相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理。
　　方法:總共選取6個人類唾液腺體標(biāo)本

2、,供者年齡在34至75歲之間。將唾液腺組織片切至35～50μm厚度后進(jìn)行培養(yǎng)。我們共使用了7種方法來對組織片培養(yǎng)過程中各項指標(biāo)進(jìn)行評估。
　　首先，在不同培養(yǎng)時間點上，通過細(xì)胞生存/死亡染色、細(xì)胞增殖染色及細(xì)胞凋亡染色分別檢測細(xì)胞存活率、增殖能力和凋亡率，從而評估細(xì)胞生理性能。所有結(jié)果都通過共聚焦顯微鏡協(xié)助完成。
　　功能評估方面，定量檢測α淀粉酶活性以及鈣離子釋放活力從而評估培養(yǎng)過程中腺泡細(xì)胞的分泌功能。
　　最后通

3、過免疫熒光（IF）染色和實時定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)（q PCR）分別檢測人類唾液腺組織片中各項蛋白和基因表達(dá)。IF染色檢測的蛋白為Na+- K+-2Cl-鈉鉀氯共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NKCC1）、水通道蛋白5（AQP5）、角蛋白5（CK5）及α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）。q PCR使用磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，管家基因）作為內(nèi)參基因，NKCC1、AQP5、CK5和鈣黏蛋白為目地基因。
　　我們總共觀察培養(yǎng)過程中的4個時間點，分別為

4、0、3、7和14天，并對每個時間點的組織標(biāo)本做以上7種檢測。
　　結(jié)果：在本研究建立的培養(yǎng)系統(tǒng)中，人類腺體組織片能夠成功的在體外進(jìn)行培養(yǎng)。人類唾液腺組織經(jīng)過14天的培養(yǎng)后，存活率雖然從第0天的70％下降至第14天的40%，但仍可證明唾液腺細(xì)胞得以留存超過兩周。細(xì)胞增殖率維持在6%至17%之間，甚至在培養(yǎng)的中后期出現(xiàn)了上升趨勢，可證明細(xì)胞及組織片的增殖能力同樣得以存留。淀粉酶活性定量檢測表明在14天的培養(yǎng)過程里，組織片中功能細(xì)胞（腺

5、泡細(xì)胞）仍然保留了一定的分泌功能。鈣離子釋放檢測的陽性結(jié)果同樣證明組織片仍具備唾液腺體生理功能。我們能夠通過IF及q PCR檢測到腺泡細(xì)胞，導(dǎo)管細(xì)胞，肌上皮細(xì)胞的蛋白和基因標(biāo)志物的表達(dá)，說明腺泡細(xì)胞，導(dǎo)管細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞都成功的存活于本研究所建立的3D組織片培養(yǎng)模型中。
　　結(jié)論：通過持續(xù)14天的觀察和評估，結(jié)果表明本研究所建立的培養(yǎng)系統(tǒng)可成功的培養(yǎng)人類SG組織片，所培養(yǎng)的腺體組織可以保持重要的生理功能。通過本實驗建立的培養(yǎng)模型，