海洋微生物高效生產(chǎn)19，20-環(huán)氧細(xì)胞松弛素Q和吡咯喹啉醌的研究.pdf

1、19，20-環(huán)氧細(xì)胞松弛素Q(B5A)和吡咯喹啉醌(PQQ)是能從海洋微生物的發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化得到的活性天然產(chǎn)物。B5A是從炭角菌中分離得到的一種細(xì)胞松弛素，具有抑制HIV病毒、抗瘧疾等多種生物活性。PQQ是一種產(chǎn)自革蘭氏陰性菌的氧化還原酶的輔酶，具有刺激細(xì)胞生長(zhǎng)和抗衰老等多種功能。本文開展海洋微生物分別高效生產(chǎn)B5A和PQQ的系列研究。
　　首先開展海洋真菌炭角菌高產(chǎn)B5A的系統(tǒng)研究。對(duì)從深海來源的B5A生產(chǎn)菌株Xylaria

2、 sp.sof11進(jìn)行18S rDNA序列鑒定，進(jìn)一步確定該菌株屬于炭角菌屬。建立了高效的產(chǎn)物測(cè)定方法，包括高效液相檢測(cè)、薄層層析以及液質(zhì)聯(lián)用，優(yōu)化其檢測(cè)條件。單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二糖和多糖是較優(yōu)的碳源，魚粉和玉米粉是較優(yōu)的氮源;通過PB實(shí)驗(yàn)確定三個(gè)重要的影響因素:蔗糖、魚粉和裝液量;通過響應(yīng)面分析獲得三個(gè)顯著因素的最佳響應(yīng)值。在優(yōu)化條件下B5A的產(chǎn)量達(dá)到443.1±16.8 mg/L，是初始產(chǎn)量的4.4倍。
　　在10 L發(fā)酵罐上以蔗

3、糖為碳源進(jìn)行分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)。結(jié)果表明在溶氧大于40％、pH為6.5±0.1的條件下，流加蔗糖和魚粉，B5A產(chǎn)量達(dá)到528mg/L，與搖瓶培養(yǎng)相比提高了約19.2％。
　　建立了從發(fā)酵液中分離純化B5A的工藝路線，包括如下主要步驟:菌體萃取、硅膠柱層析和C18半制備層析。經(jīng)過萃取和層析工藝的參數(shù)優(yōu)化研究，獲得了純度超過98％的B5A產(chǎn)品，回收率達(dá)到76％。
　　其次開展海洋微生物噬甲基首產(chǎn)PQQ的系統(tǒng)研究。篩選得到一株

4、產(chǎn)PQQ的海洋微生物，經(jīng)過形態(tài)和16S rDNA序列鑒定，確定該菌株為噬甲基菌屬，命名為Methylophaga sp.ZJU414。單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)碳源對(duì)PQQ合成的影響很大，而溶氧和氮源等對(duì)PQQ合成影響較小。在3 L發(fā)酵罐中以甲醇為碳源進(jìn)行分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)，流加甲醇后，PQQ的合成量達(dá)到12.9 mg/L。
　　建立了用陰離子交換樹脂從發(fā)酵液中吸附分離PQQ的工藝路線。該工藝路線的特點(diǎn):1）通過平衡吸附容量、洗脫容量和吸

5、附率的比較獲得了價(jià)格低廉且具有良好吸附和解吸性能的LKA98樹脂;2）研究了PQQ在LKA98樹脂上的吸附平衡和動(dòng)力學(xué)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)朗格繆爾方程對(duì)吸附平衡數(shù)據(jù)有很好的擬合效果;3）考察了PQQ在LKA98樹脂柱上的洗脫附規(guī)律，優(yōu)化分離工藝。發(fā)現(xiàn)Thomas、Yoon-Nelson和Adams-Bohart三種模型都可以很好地模擬吸附過程的進(jìn)行;所得產(chǎn)品的回收率達(dá)到87.3％，且純度能提高到93.8％;4）完善了結(jié)晶工藝條件，使結(jié)晶的收率和純