氧化葡萄糖酸桿菌合成吡咯喹啉醌的研究.pdf

1、吡咯喹啉醌是繼煙酰胺、核黃素輔酶之后第三類(lèi)輔酶，為B族維生素新成員，具有重要的生理功能，因此，大規(guī)模制備吡咯喹啉醌具有重要的意義。由于化學(xué)合成步驟多、產(chǎn)率低、異構(gòu)體和副產(chǎn)品的去除需要多步純化，且重金屬催化劑不利于環(huán)境，生物合成吡咯喹啉醌是目前大規(guī)模制備最好的途徑，為此，本課題主要研究了氧化葡糖桿菌合成吡咯喹啉醌的發(fā)酵條件、分離純化及酶法合成的分子基礎(chǔ)，具體如下：
　　1、氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵制備PQQ的條件研究
　　用單因素

2、試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的方法對(duì)氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，氧化葡糖桿菌發(fā)酵制備PQQ的培養(yǎng)基成分最佳添加量為谷氨酸4g/L，酪氨酸4g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O5mg/L，此時(shí)合成PQQ最多為0.813ml/L，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。運(yùn)用單因素分析方法進(jìn)行了氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化，結(jié)果表明，pH值為6.5，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為200r/min為最佳發(fā)酵條件。
　　2、氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵液中PQQ的分離純

3、化研究
　　PQQ的結(jié)構(gòu)中包含3個(gè)羧基，顯色酸性。根據(jù)這個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用絡(luò)合萃取法對(duì)其進(jìn)行分離純化，發(fā)酵液經(jīng)高速離心，將上清液在雙溶質(zhì)萃取體系進(jìn)行絡(luò)合萃取，其中三辛胺為絡(luò)合劑，正己烷為稀釋劑，得到富含吡咯喹啉醌的上層液，再用氨水反萃，減壓濃縮后冷凍干燥，得到單一產(chǎn)物。經(jīng)HPLC檢測(cè)純度可達(dá)到90％以上。該方法條件簡(jiǎn)單、過(guò)程快捷、便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
　　3、氧化葡萄糖酸桿菌PQQ合成基因簇的克隆與表達(dá)及酶法合成研究

4、　　經(jīng)過(guò)菌體發(fā)酵生產(chǎn)PQQ的嘗試，我們進(jìn)一步用單純且可控的無(wú)細(xì)胞體系合成吡咯喹啉醌。LC-MS結(jié)果顯示，PQQ是可以體外合成的，它的前體是多肽PqqA。在各種酶的作用下，PqqA經(jīng)歷了一系列變化最終生成PQQ，但是各種酶反應(yīng)機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。為此，我們克隆和表達(dá)了氧化葡糖桿菌合成PQQ的基因簇各種酶的基因，并通過(guò)His-標(biāo)簽鎳離子分離柱對(duì)粗蛋白進(jìn)行純化與濃縮，獲得了重組菌種、重組質(zhì)粒及酶等生物材料，嘗試了酶法合成吡咯喹啉