吡咯喹啉醌高產(chǎn)菌的篩選、誘變、發(fā)酵及基因克隆.pdf

1、吡咯喹啉醌(PQQ)是一種新型的氧化還原型輔酶，具有許多生物功能，近幾年來成為研究熱點。本論文主要致力于吡咯喹啉醌產(chǎn)量方面的研究，分為以下四個章節(jié)。
　　 1、本實驗篩選獲得一株高產(chǎn)吡咯喹啉醌菌株，經(jīng)生理生化實驗和16S rRNA鑒定屬于假單胞菌屬，命名為Pseudomonas sp.0813，簡稱:PS0813。用非酶檢測法和高效液相色譜檢測PS0813合成的PQQ能力，該菌種在未經(jīng)過任何優(yōu)化和基因工程改造下合成能力達到258

2、mg/L。
　　 2、由于其出色的產(chǎn)PQQ能力，對其進行發(fā)酵以得到更高產(chǎn)量。實驗中，進行單因素實驗及正交實驗。對PS0813的培養(yǎng)基成分以及發(fā)酵條件進行研究。優(yōu)化后依次對PS0813進行搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐實驗，發(fā)酵補料采用流加碳氮源和無機鹽的方法，PQQ產(chǎn)量分別最高可達到448 mg/L和695 mg/L。這在未經(jīng)任何誘變或基因工程改造條件下的天然菌株中，居于最高產(chǎn)量。
　　 3、之后為了進一步提高產(chǎn)量對其進行誘變育種。本

3、研究采用紫外-NaNO2復合誘變進行篩選，分別研究紫外的致死率和正突變率以及NaNO2致死率和正突變率，最終誘變劑量為紫外照射30 S之后與0.1M的NaNO2反應5min的條件下誘變效果最好，篩選出兩株高產(chǎn)誘變株P(guān)M1和PM2，經(jīng)傳代培養(yǎng)2代確定其具有遺傳穩(wěn)定性。對PM1和PM2進行發(fā)酵，產(chǎn)量分別比原代菌產(chǎn)量提高1.63倍和1.56倍。
　　 4、為了在基因水平上對PS0813菌株進一步研究，對該菌株的PQQ合成基因簇進行擴增