氮離子注入赤蘚糖醇生產(chǎn)菌誘變篩選高產(chǎn)菌株

1、創(chuàng)新與借鑒中國釀造2012鼉蓁翌囂9期139——————————————————————————————————————————————————————————一。氮離子注入赤蘚糖醇生產(chǎn)菌誘變篩選高產(chǎn)菌株孟小琴1，胡永紅k，楊文革，沈飛：，李棟蕓z，于輝：，馮旌z(1南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京210009；2南京新百藥業(yè)有限公司，江蘇南京210038)摘要：為了獲得赤蘚糖醇高產(chǎn)菌株，以釀酒酵母N，wGYH30566為研究對

2、象，利JEjN注入進行誘變。注入N的能量為15keV，劑量為20x1014cm240x1014Cm260x1014cm280x10“cm2、100x1014cm。、120x101cm。。結(jié)果表明最佳注入劑量為801014cm。，選育出一株赤蘚糖醇高產(chǎn)菌株H32，赤蘚糖醇產(chǎn)量提高1752％，且副產(chǎn)物甘油降低269％，經(jīng)連續(xù)10代遺傳穩(wěn)定性試驗考察，其高產(chǎn)性能穩(wěn)定，極大提高了生產(chǎn)效率。關(guān)鍵詞：氮離子注入；誘變；赤蘚糖醇：釀酒酵母中圖分類號：

3、Q93997文獻標(biāo)識碼：A文章編號：0254—5071(2012)09—0139—03ScreeningofthehighyielderythritolproducingstraillbyimplantationwithNionMENGXiaoqinl，HUYonghong，YANGWengel，SHENFei2，LIDongyun2，YUHui2，F(xiàn)ENGJinga(|CollegeofBiotechnologyandPharmace

4、uticalEngineeringNanjingUniversRyofTechnologyNanjin9210009China；2NanjingXinbaiPharmaceuticalCo，LtdNanjin9210038Ch洫a)Abstract：NionimplantationwasusedtomutateSaccharomycescerevisiaeNJWGYH30566forobtaininghigtle卜yielderythr

5、itolstrainTheoriginalstrainwasmutatedby15keVNionimplantationwiththedoseof20x1014cm。，40x1014cm～，60x1014cm。，80x1014cm‘，100x1014cm。，and120x1014cm～，respectivelyResultsshowedthattheoptimalNiondosewas80x1014cm。，andastrainofhig

6、hyielderythritolwasobtainedandnamedasH32Erythritolyieldofthemutantwasincreasedby1752％andbyproductglycerolwasdecreasedby269％comparedtothoseoftheoriginalstrainSubcultureresultsshowedthatthemutantstrainshadhi【曲geneticstabil

7、ityKeywords：Nimplantation；mutation；erythritol；Saccharomycescerevisiae赤蘚糖醇是一種高附加值的多元醇類甜味劑，廣泛存在于真菌類、水果及發(fā)酵食品中，同時也存在于人和動物的組織及體液中[12]。赤蘚糖醇具有安全性高、熱量低、口感佳等特點，并且在人體中不參與糖代謝和血糖變化，在結(jié)腸中不發(fā)酵，因此特別適用于糖尿病和肥胖患者。近幾年來，隨著經(jīng)濟的發(fā)展和生物技術(shù)的不斷改善，功能性甜

8、味劑赤蘚糖醇已成為國內(nèi)外競相開發(fā)的焦點，目前赤蘚糖醇主要應(yīng)用于食品加工業(yè)和醫(yī)藥保健業(yè)同。離子束注入技術(shù)是一種新型的生物誘變技術(shù)，可用于遺傳育種和基因工程等領(lǐng)域【4】。N是目前常注入細胞的活性離子之一，N注入細胞后將與周圍的移位原子、本底原子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生新的分子或基團而沉積下來，將直接導(dǎo)致DNA的損傷和突變，從而對生物體產(chǎn)生明顯的誘變優(yōu)勢[51。目前微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)赤蘚糖醇能力低，副產(chǎn)物甘油含量高，需要對生產(chǎn)菌進行改良。傳統(tǒng)誘變方

9、法是不定向、低頻性的，導(dǎo)致篩茵的工作量較大，直接影響誘變育種效率。本實驗室利用N注入技術(shù)，對從糖廠廢液中分離到的釀酒酵母NJWGYH30566進行改良，以提高赤蘚糖醇的產(chǎn)量，降低副產(chǎn)物甘油含量。同時對特異突變株的生物學(xué)特性進行詳盡研究，為其進一步工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1材料與方法11菌種釀酒酵母NJWGYH30566，本實驗室保藏。12培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基(g／L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂16，pH值自然。種子培養(yǎng)基(e／L)：葡萄

10、糖150，酵母膏10，玉米漿3，pH值自然。發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：葡萄糖200，酵母膏20，玉米漿10，MgS047H2003。MnCl24H200005，CuS04‘5H200005，ZnS047H200008，pH值為72～74。以上培養(yǎng)基于101x105Pa高壓下，121％蒸氣滅菌20min。1。3氮離子注入131樣品制備取在PDA培養(yǎng)基上活化后的菌種，挑取1~2環(huán)接入20mU250mL的種子培養(yǎng)基中，29％下恒溫培養(yǎng)26h29h

11、至對數(shù)期。取011IlL液體菌種均勻涂布于無菌培養(yǎng)皿上，無菌風(fēng)吹干后進行N牲入誘變。132注入方式N駐入機為LZD900多功能離子注入機。實驗采用15keV的注入能量，注入劑量為0(對照)、20x1014cm240x1014cm2、60)(1014cm2、801014cm2、lOOxl014cm2、120x1014cm五，靶室真收稿日期：2012—06—28基金項目：國家自然科學(xué)基金G1171644)；江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻性聯(lián)合研究項目(S

12、BY201120075)；江蘇省科技廳科技支撐計劃農(nóng)業(yè)部分mE2011354)作者簡介：孟小琴(1988一)，女，碩士研究生，研究方向為生物分離與發(fā)酵：胡永紅，教授，博導(dǎo)，通訊作者。萬方數(shù)據(jù)創(chuàng)新與借鑒中國釀造2012蓋莖碧繁9期141——————————————————————————————————————————————一一為了確保獲得的菌株具有優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性，分別對菌株H一2、H一32和H49做遺傳穩(wěn)定性考察。經(jīng)傳代后，有些菌株

13、生產(chǎn)赤蘚糖醇的含量明顯下降，其中編號為H32菌株的遺傳穩(wěn)定性較好，結(jié)果如表2所示。表2高產(chǎn)突變株H82遺傳穩(wěn)定性實驗Table2The驢n酣cstabH時ofhighyioldmutantstrainH3224高產(chǎn)菌株H32的發(fā)酵分析240，2107180曲∑150簍120羹囂憔30出發(fā)菌H320lO203040506070時間／Il圖3高產(chǎn)突變菌H32和出發(fā)菌搖瓶發(fā)酵赤蘚糖醇濃度曲線Fig3Erythritolproductionfe

14、rmentedbybighy蛔IdmutantstrainH一32andoriginalstrain由圖3可以看出，在發(fā)酵前期，出發(fā)菌的發(fā)酵水平略高于高產(chǎn)菌，此階段菌體均處于生長期。但到了中后期高產(chǎn)菌H一32產(chǎn)量迅速上升，到60h時達到高峰期，產(chǎn)物積累刪2289／L，60h后趨于平緩下降，而出發(fā)菌發(fā)酵能力只能維持到55h左右。3結(jié)論N誘變育種與傳統(tǒng)物理法及化學(xué)誘變劑相比，具有損傷輕、突變率高、突變譜寬、遺傳穩(wěn)定，易于獲得理想菌株等特蒯n

15、】。實驗通過運用N牲入技術(shù)誘變赤蘚糖醇產(chǎn)生菌，獲得一株高產(chǎn)突變菌株H32，赤蘚糖醇產(chǎn)量高達2289／L2E右，副產(chǎn)物甘油僅為321班，且遺傳穩(wěn)定，目前處于國內(nèi)最好水平，為下一步培養(yǎng)基優(yōu)化及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。研究表明，在Ⅳ注入(15keV，80x104cmO劑量下，誘變的正突變率較高，可達到346％。參考文獻：【1】MOONHI，JEYAMKIMIW，eta1Biotechnologicalproductionofcrythdtolan

16、ditsapplications叨AppiMicrobiolBiot，2010，86(4)：1017—1025【2】唐瓔，孟憲剛新型天然生物功能食品添加劑的研究與開發(fā)【J】食品工業(yè)科技，2011(3)：432437【3】SAVERGAVELS，GADRERV，NARAYANANBKeta1Strainimprovementandstatisticalmediaoptimizationforenhancedewthritolproduct

17、ionwithminimalbyproductsfromCand／damagno／／aemutantR23[f1BioehemEngJ，201l，55(22)：92100【4】宋道軍離子注入效應(yīng)研究陰核技術(shù)，1999，22(3)：129132[5】5余增亮離子柬與生命科學(xué)——一個新的研究領(lǐng)域忉物理，1997，26(6)：333338【6】6胡永紅，楊文革，孟小琴一種從酵母發(fā)酵液中分離純化赤蘚糖醇的方法唧中國：CNl02249856A，2

18、01l1123【7】HUYHJIANGXMYANGWG，eta1Solubilityofev：hritotindiffereat越lu∞璐solventmixtu惜[f1JMolLiq，2012，169：7479[8】8楊垂緒，梅曼彤太空放射生物學(xué)口田廣州：中山大學(xué)出版社，1995【9】WU1J，RANDERSPEHRSONG，XUA’da1Targetedcytoplasmicitradiationwithalphaparticles