離子注入D-核糖產(chǎn)生菌的誘變效應(yīng)及作用機(jī)理研究.pdf

1、D-核糖，是一種極為重要的戊糖。它是生物遺傳物質(zhì)mRNA、rRNA、5sRNA等各種RNA及許多輔酶和維生素的構(gòu)成成分，在生物體內(nèi)通常與磷酸共同轉(zhuǎn)運(yùn)，具有十分重要的生理、生化作用，并且在制藥行業(yè)、臨床醫(yī)學(xué)、食品行業(yè)、化妝品和飼料行業(yè)等相關(guān)行業(yè)具有廣泛應(yīng)用，目前D-核糖的工業(yè)生產(chǎn)通常采用微生物發(fā)酵法。
　　 國內(nèi)目前生產(chǎn)采用的發(fā)酵菌種為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)轉(zhuǎn)酮醇酶變異株，它對發(fā)酵產(chǎn)物的耐受性較差，發(fā)酵轉(zhuǎn)

2、化率較低，從其發(fā)酵液中提取高純度發(fā)酵產(chǎn)物也比較困難，盡管采用了多種理化方法進(jìn)行誘變，但國內(nèi)該菌株對D-核糖的耐受性沒有明顯改善，因而其發(fā)酵水平一直沒有明顯提高。
　　 作為一種具有獨(dú)特的誘變機(jī)理和生物效應(yīng)的誘變源，離子束在誘變育種方面的應(yīng)用極為迅速。離子注入是集物理誘變和化學(xué)誘變特性于一體的綜合誘變方法，能夠在低劑量注入、細(xì)胞損傷較輕的情況下，強(qiáng)烈地影響生物細(xì)胞的生理、生化性能，造成遺傳物質(zhì)的基本單位——堿基的改變，誘發(fā)染色體結(jié)

3、構(gòu)變異。該技術(shù)能以較小的生理損傷得到較高的突變率、較廣的突變譜，并且具有設(shè)備簡單、使用方便、成本低廉、對人體和環(huán)境無害等優(yōu)點。在微生物誘變育種的研究中，利用離子注入進(jìn)行菌種改良已經(jīng)取得令人矚目的研究成果。
　　 本論文旨在研究低能氮離子注入D-核糖產(chǎn)生菌的誘變效應(yīng)及其作用機(jī)理，并篩選出高產(chǎn)菌株。本論文分四部分對該內(nèi)容進(jìn)行了研究，具體如下:
　　 第一部分:考察出發(fā)菌株的生物轉(zhuǎn)化性能
　　 對現(xiàn)有的生產(chǎn)D-核糖的菌

4、株——枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisW-1)的生物轉(zhuǎn)化性能進(jìn)行了考察，結(jié)論如下:
　　 活化出的該出發(fā)菌株的生長速率較快，菌體狀況良好，遺傳性能穩(wěn)定，經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72h，其產(chǎn)糖量可穩(wěn)定在65.3g/L左右，能夠用于后續(xù)的離子注入誘變。
　　 第二部分:研究低能氮離子注入D-核糖產(chǎn)生菌的誘變效應(yīng)
　　 利用離子注入技術(shù)誘變D-核糖產(chǎn)生菌——枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)酮醇酶變異株，結(jié)果顯示，誘變菌種存活率與N+

5、離子注入劑量的關(guān)系呈現(xiàn)典型的馬鞍型曲線，突變率隨劑量的增加而提高，到達(dá)一定程度后，再提高劑量，突變率下降，正突變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負(fù)變較多出現(xiàn)在偏高劑量中。根據(jù)誘變菌種存活率和正突變率的計算確定離子注入能量10keV，誘變注入最佳劑量為12×1014ion/cm2。在最佳誘變劑量下篩選獲得一株高產(chǎn)穩(wěn)定的突變菌株。
　　 本實驗結(jié)果與現(xiàn)代育種理論相一致，表明離子注入誘變技術(shù)應(yīng)用于D-核糖產(chǎn)生菌菌種的選育可以獲得較為理想的突變

6、株。
　　 第三部分:研究低能離子對D-核糖產(chǎn)生菌株的作用機(jī)理
　　 研究了采用不同劑量低能氮離子輻照后的D-核糖生產(chǎn)菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，探索了離子注入對菌體蛋白分子表達(dá)層面的影響。對離子注入誘變后的菌體總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳實驗，蛋白電泳結(jié)果顯示，在不同誘變劑量作用下的各菌株蛋白，在許多條帶上發(fā)生了有無和明暗的變化，表明離子注入對菌體的損傷是可遺傳的和多位點廣譜型的，從而為進(jìn)一步定向改造菌株奠定了基礎(chǔ)。

7、
　　 第四部分:優(yōu)化高產(chǎn)菌株的發(fā)酵條件
　　 確定了經(jīng)過氮(N+）離子注入誘變篩選得到的高產(chǎn)菌株BacillussubtilisW-N-23的最佳發(fā)酵培養(yǎng)及發(fā)酵條件，最大限度的發(fā)揮了高產(chǎn)菌株的生物轉(zhuǎn)化性能，提高了D-核糖的產(chǎn)量。
　　 根據(jù)正交試驗結(jié)果，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的組成是:葡萄糖21.0％、玉米漿2.8％、(NH4)SO40.9％、CaCO32.0％、MnSO4·4H2O0.005％。確定的最適發(fā)酵培養(yǎng)條件