離子注入誘變Blakeslea trispora(-)菌主其發(fā)酵制備類胡蘿卜素的工程放大研究.pdf

1、β-胡蘿卜素和番茄紅素都是具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的類胡蘿卜素，國(guó)內(nèi)用三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)發(fā)酵生產(chǎn)這兩種類胡蘿卜素已形成產(chǎn)業(yè)化，但發(fā)酵水平低，生產(chǎn)成本高。本文研究了低能N+注入B.trispora(-)的誘變效應(yīng)、高產(chǎn)菌株的篩選及穩(wěn)定性、優(yōu)化了高產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素和番茄紅素的工藝，探討了5L、100L及1000L發(fā)酵罐放大規(guī)律并實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
　　 從生理和生化的角度研究低能N+注入

2、B.trispora(-)的誘變效應(yīng)表明：(1)由考夫曼源和雙潘寧源發(fā)生的N+注入B.trispora(-)的存活率-注量曲線都呈“馬鞍型”，但“馬鞍點(diǎn)”位置不同，分別在注量為90×1014N+·cm-2和120×1014N+·cm-2處，其中用雙潘寧源處理B.trispora(-)更有助于促進(jìn)菌體合成類胡蘿卜素；(2)注入10keV和15keV的N+對(duì)菌體細(xì)胞的損傷效應(yīng)明顯大于5keV，且用10keV的N+處理B.trispora(-

3、)有助于促進(jìn)菌體合成類胡蘿卜素；(3)在注入能量相同的情況下，不同注量的N+注入B.trispora(-)的正突變率隨著注量的增加先增大后減小，在注量為120×1014N+·cm-2時(shí)正突變率最高；(4)在注量低于60×1014 N+·cm-2的條件下，POD、CAT和SOD酶的活力均隨著注量的增加而降低，此時(shí)B.trispora(-)清除自由基的能力和總抗氧化能力也隨之減弱；當(dāng)注量高于60×1014N+·cm-2后，CAT和CuZn-

4、SOD活力開(kāi)始逐步下降，而此時(shí)B.trispora(-)清除O2-和OH的能力卻出現(xiàn)了增強(qiáng)。據(jù)此推測(cè)離子注入誘導(dǎo)的B.trispora(-)菌體內(nèi)所增加的類胡蘿卜素也具有類似CAT和CuZn-SOD的抗氧化功能，它使菌體清除自由基的能力有所增強(qiáng)；離子注入生物體所誘導(dǎo)的總抗氧化能力的變化則很可能是導(dǎo)致生物體存活率-注量曲線呈現(xiàn)“馬鞍型”特征變化的原因之一。
　　 構(gòu)建N+注入B.trispora(-)存活率-注量效應(yīng)模型、突變率-

5、注量效應(yīng)模型以及誘變產(chǎn)生正突變株的效果收益模型，用以指導(dǎo)B.trispora(-)誘變選育工作的進(jìn)行，也為其他霉菌的誘變選育提供參考。
　　 用離子束對(duì) B.trispora(-)進(jìn)行誘變選育，結(jié)合測(cè)定菌體抗氧化酶活性的變化，篩選出BH3-701等三株類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株。連續(xù)五代遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性較好，其中BH3-701生產(chǎn)β-胡蘿卜素的平均產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高78.7％，表現(xiàn)出很強(qiáng)的發(fā)酵積累β-胡蘿卜素的

6、能力。
　　 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得BH3-701菌株種子培養(yǎng)基的組成為玉米粉40g.L-1，黃豆粉20g.L-1，麥芽浸粉20g.L-1，磷酸二氫鉀2g.L-1，維生素B12mg.L-1，硫酸鎂0.5g.L-1；發(fā)酵的組成為玉米粉30g，L-1，黃豆粉30g.L-1，玉米油30g.L-1，葡萄糖30 g.L-1，磷酸二氫鉀2g.L-1，維生素B12mg.L-1，硫酸鎂0.5g.L-1，Tween801.0g.L-1。
　　 優(yōu)

7、化的β-胡蘿卜素發(fā)酵工藝條件為：初始pH值7.0，搖床轉(zhuǎn)速240r.min-1，溫度28℃、500mL搖瓶的裝液量為50mL，接種量(體積分率)10％、正負(fù)菌的接種比例(體積比)1:10，在此條件下?lián)u瓶發(fā)酵β-胡蘿卜素的產(chǎn)量可達(dá)到3.5g.L-1。
　　 實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的添加環(huán)化酶抑制劑發(fā)酵番茄紅素的工藝為：搖瓶發(fā)酵--發(fā)酵到48h時(shí)，加入濃度為1.0g.L-1的2-氨基-5甲基吡啶，在此條件下番茄紅素的產(chǎn)量可達(dá)到1.5g.L-1。

8、發(fā)酵罐中發(fā)酵--當(dāng)發(fā)酵液中β-胡蘿卜素的含量達(dá)到0.1g.L-1左右時(shí)加入1.0g.L-1的2-氨基-5甲基吡啶，可以有效抑制番茄紅素環(huán)化酶的活性，促進(jìn)番茄紅素的合成。其他條件不變，在發(fā)酵進(jìn)行到24h時(shí)，以50mg.L-1的添加量加入三孢酸，可以使搖瓶中番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到1.65g.L-1。在發(fā)酵番茄紅素的過(guò)程中添加三孢酸尚處于搖瓶研究階段，本文采用添加環(huán)化酶抑制劑(2-氨基-5甲基吡啶)的工藝發(fā)酵番茄紅素。
　　 考察了5L發(fā)

9、酵罐中分批發(fā)酵過(guò)程規(guī)律以及操作條件(如溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量)對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，比較5L、100L和1000L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素和番茄紅素的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高的溶解氧對(duì)于B.trispora生長(zhǎng)及類胡蘿卜素合成有著至關(guān)重要的意義，以發(fā)酵過(guò)程中體系相對(duì)溶氧值作為放大類胡蘿卜素發(fā)酵過(guò)程的依據(jù)簡(jiǎn)便、易行、可靠，對(duì)類胡蘿卜素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有實(shí)用價(jià)值。
　　 適合1000L罐發(fā)酵β-胡蘿卜素的操作條件為：工作體積700L，培養(yǎng)

10、基初始pH值7.0，溫度28±0.5℃，在罐壓為0.08MPa左右，攪拌轉(zhuǎn)速50r.min-1～150r.min-1，通氣量1.2vvm～1.5vvm范圍內(nèi)按5L發(fā)酵過(guò)程體系相對(duì)溶氧曲線調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程的相對(duì)溶氧值，在此條件下發(fā)酵72h左右，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量為3.2g.L-1；將發(fā)酵溫度控制改為25±0.5℃，其他條件不變，當(dāng)發(fā)酵至β-胡蘿卜素的含量為0.1g.L-1時(shí)加入1.0g.L.1的2-氨基-5甲基吡啶繼續(xù)至96h左右終止發(fā)酵，番