D-核糖的菌種選育及發(fā)酵研究.pdf

1、D-核糖是遺傳物質(zhì)核酸的組成成分，也是若干輔酶和維生素的組成部分，具有重要的生理作用。近年來利用D-核糖生產(chǎn)抗癌和抗病毒藥物已顯示出了強(qiáng)大的生命力。目前，最主要的生產(chǎn)方法是微生物發(fā)酵法。查考了國內(nèi)外D-核糖發(fā)酵的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展后，本論文以Bacillus Subtilis HGD107和Bacillus Subtilis104為出發(fā)菌，分別采用理化誘變(UV、DES)和基因工程的方法育種，最后獲得了一株轉(zhuǎn)酮酶缺陷型基因工程菌B.S pT

2、n15-1。用地衣酚顯色法確定了測定D-核糖產(chǎn)量的公式，并對工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵條件優(yōu)化，摸索出了最佳搖瓶發(fā)酵條件。 1.以Bacillus Subtilis HGD107為出發(fā)菌，采用UV和DES誘變，確定了紫外線、硫酸二乙酯的最佳誘變劑量：紫外燈20w距離30cm處照射30s。硫酸二乙酯濃度為1％(v/v)，30min。選育出D-核糖產(chǎn)量較高的誘變株UD-30<'＃>，D-核糖產(chǎn)量從4.67g/L提高到為24.03

3、g/L。 2.以Bacillus Subtilis 104為出發(fā)菌，采用同源重組法高效構(gòu)建枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)酮酶(tkt)缺失突變菌株。以大腸桿菌質(zhì)粒pBlUSKM為框架，構(gòu)建出基于枯草桿菌(B.S104)tkt基因位點(diǎn)的整合載體pb-Trs-n。將此載體重組到B.S104中，從新霉素抗性平板上挑取轉(zhuǎn)化子。整合載體pb-Trs-n的測序結(jié)果與Kunst.F報(bào)道的tkt基因高度同源(98.9％)。同源重組后，B.S104染色體上的tk

4、t基因(2004bp)部分與載體pb-Trs-n的neo基因(1197bp)發(fā)生了同源交換，確定了該轉(zhuǎn)化子為枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)酮酶缺失突變株(tkt，neo<'r>)。重組菌B.S pTn15-1D-核糖產(chǎn)量從4.81g/L提高到31.75g/L。考察了基因工程菌的傳代穩(wěn)定性，該菌傳代5代后D-核糖的產(chǎn)量沒有明顯下降，表明該菌株較為穩(wěn)定。 3.對基因工程菌B.S pTn15-1進(jìn)行了培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化。培養(yǎng)基優(yōu)化采用了單因子組合法

5、和正交試驗(yàn)法，得出最適培養(yǎng)基配方為(％，w/v)：葡萄糖15(補(bǔ)料)，玉米漿2.5，(NH<,4>)<,2>SO<,4> 1.1，MnSO<,4> 0.005，KH<,2>PO<,4> 0.3，CaCO<,3> 1.0(分消)。通過試驗(yàn)得出最適發(fā)酵條件為：初始pH 7.0，發(fā)酵溫度37℃；搖床轉(zhuǎn)速180r/min，接種量10％，裝液量300mL三角瓶裝30mL未接種發(fā)酵液，發(fā)酵液中添加5μg/mL的新霉素，采用24h和48h分批補(bǔ)糖發(fā)酵