D-海因酶產(chǎn)生菌的篩選、性質(zhì)及固定化研究.pdf

1、本文以DL-對羥基苯海因(DL-p-HPH)為唯一氮源，從自然資源中進(jìn)行D-海因酶產(chǎn)生菌株的篩選。利用雙層平板法和微孔快速篩選法，共篩得三株有活力的菌株，對其中活力較好的一株進(jìn)行了深入研究。對上述菌株進(jìn)行培養(yǎng)后，加入底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液用TLC法和HPLC法液進(jìn)行了初步鑒定。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化液中在與產(chǎn)物對羥基苯甘氨酸(D-p-HPG)標(biāo)樣相同的Rf值處，有對應(yīng)的斑點(diǎn)出現(xiàn)。后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用NaNO2進(jìn)行處理后進(jìn)一步提純分離，使用了732型陽

2、離子樹脂，上柱的流速為2ml/min，而后用0.2mol/L的NaOH溶液以0.4mL/min的速度進(jìn)行洗脫。將洗脫得到的溶液濃縮結(jié)晶，得到純品后運(yùn)用HPLC、旋光度和紅外進(jìn)行了測定，確定了產(chǎn)物為D-p-HPG。
　　 在上述研究的基礎(chǔ)上，對該菌種進(jìn)行了16S rRNA鑒定，鑒定結(jié)果為革蘭氏陰性菌，產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes sp.)。通過對該菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其最適的培養(yǎng)條件為：最適碳源為甘油，氮源為酵母膏，最

3、適生長溫度為28-30℃，最佳起始pH值為pH7.0，最佳裝樣體積為50mL/250mL的三角瓶。產(chǎn)酶細(xì)胞的生物量在培養(yǎng)了48小時(shí)時(shí)達(dá)到了最高，但酶活在培養(yǎng)了大約24小時(shí)時(shí)為最高。此后又對該菌進(jìn)行了固定化，最終選擇PVA-硼酸法，并確定0.1 g/mL的PVA濃度為固定化該細(xì)胞的最適濃度，固定化過程中，在飽和的硼酸溶液中加入0.01 g/mL的Mg2+具有較好的效果。固定化后的細(xì)胞對pH的耐受范圍增大；連續(xù)反應(yīng)7批，保持相對酶活80％以