產(chǎn)葡聚糖乳酸菌的篩選誘變及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、乳酸菌能夠利用外源簡(jiǎn)單的碳水化合物，分泌多糖到體外，因其產(chǎn)生的胞外多糖或?qū)Ξa(chǎn)品質(zhì)地和風(fēng)味產(chǎn)生影響，或具有益生作用而被廣泛研究和應(yīng)用。腸膜明串珠菌是一種能夠利用蔗糖，在自身葡聚糖蔗糖酶的催化下合成葡聚糖的乳酸菌，其合成的葡聚糖在食品、醫(yī)藥、化妝品以及生化試劑行業(yè)中應(yīng)用廣泛。
　　本研究的主要內(nèi)容包括:通過分離、篩選和誘變獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的能高產(chǎn)葡聚糖的乳酸菌菌株;進(jìn)一步研究所獲得乳酸菌的葡聚糖蔗糖酶的酶學(xué)特性;最后，對(duì)菌株發(fā)酵生

2、產(chǎn)葡聚糖的培養(yǎng)基和發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。主要得到以下研究結(jié)果:
　　(1)從泡菜汁樣品中分離并篩選得到一株葡聚糖產(chǎn)量為5.24±0.14g/L的乳酸菌菌株2-17，經(jīng)生理生化鑒定及16S rDNA序列同源性分析，菌株被鑒定為腸膜明串珠菌腸膜亞種。
　　(2)通過亞硝基胍和紫外復(fù)合誘變方法提高該菌株葡聚糖產(chǎn)量，確定最佳復(fù)合誘變條件為:菌株在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)9h，經(jīng)濃度為0.5mg/mL亞硝基胍處理80min，置于30w紫外燈45

3、cm處照30s。經(jīng)兩輪復(fù)合誘變后，得到一突變菌株UN2-18，葡聚糖產(chǎn)量提高至7.54±0.08g/L，較出發(fā)菌株提高了43.89％。該突變株連續(xù)傳十代后，葡聚糖產(chǎn)量仍維持在7.5g/L左右。
　　(3)突變株UN2-18的葡聚糖蔗糖酶的最適反應(yīng)溫度為33℃，在20-30℃，酶活穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH為5.5，Mg2+、Ca2+、Mn2+對(duì)酶活力具有激活作用，低濃度Co2+具有激活作用，高濃度Co2+抑制酶活，F(xiàn)e2+具有抑制作用。E

4、DTA、尿素對(duì)酶的活性有較強(qiáng)的抑制作用。該酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為31mM，最大反應(yīng)速率Vmax為4.5 U/ml。通過SDS-PAGE、原位反應(yīng)及PAS染色確定該酶分子量大小為178kDa。突變株UN2-18生長(zhǎng)和葡聚糖蔗糖酶合成包括以下必要物質(zhì):①氨基酸:異亮氨酸、絲氨酸、組氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺;②堿基:腺嘌呤、尿嘧啶，③B族維生素:泛酸、煙酸、葉酸、吡哆醛、核黃素、

5、乳清酸、硫辛酸、肌苷、生物素，④無機(jī)鹽:K2HPO4、 MgCl2、 MnSO4。
　　(4)以不同水解程度的乳清粉、脫脂乳、豆粕以及不水解的麥麩和玉米漿粉作為氮源，比較它們對(duì)菌株葡聚糖產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)10％水解度的豆粕水解物作為氮源時(shí)，葡聚糖產(chǎn)量最高，為7.37±0.12g/L。進(jìn)一步通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化培養(yǎng)基組成，確定蔗糖濃度為9.41％，10％水解度的豆粕添加量為2.09％，K2HPO4為2.09％。在此條件

6、下，菌株對(duì)蔗糖的轉(zhuǎn)化率最高，為33.81±0.67％,此時(shí)，葡聚糖產(chǎn)量為31.8±0.63g/L。
　　(5)使用最優(yōu)培養(yǎng)基，采用10L發(fā)酵罐發(fā)酵，優(yōu)化發(fā)酵條件，得到:發(fā)酵溫度為28℃，接種量為4％，轉(zhuǎn)速為150r/min，起始pH為6.0，恒pH發(fā)酵8h后非恒pH發(fā)酵至20h放罐，葡聚糖產(chǎn)量達(dá)到34.15±0.27g/L，蔗糖轉(zhuǎn)化效率為36.29％。
　　本研究獲得一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)葡聚糖的腸膜明串珠菌腸膜亞種，誘變