eNOS解偶聯(lián)與模擬潛艇逃生大鼠肺動脈內(nèi)皮損傷的關(guān)系與血小板活化的干預研究.pdf

1、目的:
　　隨著潛艇逃生技術(shù)的發(fā)展，各國海軍模擬潛艇逃生技術(shù)在向更深的海域前進，而阻礙其前進的障礙之一就是減壓病的氣泡損傷。減壓病的機理:人體每下潛10m，大致相當于增加一個大氣的壓力。機體在高壓力的環(huán)境下，肺泡內(nèi)的各種氣體分壓增高，并平衡于吸入壓縮空氣中各種氣體的分壓相。肺泡內(nèi)的氣體分壓高于血液中的氣體分壓，因而相應地增加了氣體在血液中的溶解量。當人體由高氣壓環(huán)境快速減壓，體內(nèi)壓力超過外界總氣壓較多，于是溶解于血液或組織內(nèi)的氣體

2、在幾秒至幾分鐘內(nèi)游離為氣相，并以氣泡形式聚積，阻塞于組織和血液中;大部分的O2及CO2可迅速被血漿內(nèi)成分如:血紅蛋白所吸收，僅少數(shù)以物理狀態(tài)游離于體液中，而氮氣是惰性氣體不能被組織所吸收，可長期以氣泡狀態(tài)存在。氣泡可聚集在血管內(nèi)形成栓塞，阻礙血液循環(huán)。并可通過氣泡與血管內(nèi)皮細胞的直接接觸引起血管內(nèi)皮細胞功能障礙，內(nèi)皮依賴的血管舒張能力降低，導致遠端組織缺血、水腫及出血，排氮障礙。并有文獻報道氣泡可激活血小板，引起血小板活化聚集，即氣泡介

3、導的血小板活化bubble-induced platelet aggregation(BIPA)從而進一步阻塞血管，是形成減壓病的重要機制。
　　益肺活血顆粒(Yifei Houxue granule，YFHXG)是董建華院士根據(jù)臨床治療經(jīng)驗擬定，主要用于治療慢性阻塞性肺疾病(COPD)及肺動脈高壓(PAH)，方劑中黃芪、黨參可補益全身之氣，川芎、桃仁、赤芍、紅花等則有活血化瘀之功效。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明川穹根莖中可提取分離出一種生物

4、堿單體:四甲基吡嗪，即川芎嗪，是臨床效果公認的活血化瘀中藥提取物。川芎嗪可抑制血小板聚集和降低血小板活性、增加冠狀動脈和腦血管血流、降低血液粘度、改善微循環(huán)及血液流變性等，具有擴張血管的作用?？紤]模擬潛艇逃生大鼠患減壓病機制中存在BIPA，基于該制劑有活血作用，我們采用該方劑研究其對減壓病是否存在干預作用。
　　國內(nèi)外學者普遍認為，不安全減壓可導致血管及組織內(nèi)氣泡形成。相關(guān)研究表明不論氣泡直徑是否大于血管管徑、無論氣泡數(shù)目多少，它

5、的流向、流速及流態(tài)均取決于血管的功能狀態(tài)。氣泡作為一種流體，在血流、血壓的作用下，可變形通過各種管徑、各種走形的血管，繼而隨著血液循環(huán)。只有當血管功能障礙導致血管痙攣閉鎖和血液停滯，才引起氣泡無出路。當血壓的作用力小于血管閉合時，氣泡呈靜止狀態(tài)，導致減壓病的發(fā)生。因此，我們推測減壓病可影響血管舒張能力。血管舒張分為內(nèi)皮依賴性血管舒張及非內(nèi)皮依賴性血管舒張。內(nèi)皮依賴性血管舒張可由乙酰膽堿、緩激肽等刺激引起，主要介導生理刺激下引起的血管舒張

6、。NO是內(nèi)皮依賴性血管舒張的重要因子。NO由一氧化氮合成酶(NOS)合成，NOS包括內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、神經(jīng)型一氧化氮合成酶(nNOS)三型，nNOS為神經(jīng)型，多位于神經(jīng)元細胞;iNOS為誘導型，在炎癥的病理狀態(tài)下可誘導生成;eNOS在血管內(nèi)皮細胞中穩(wěn)定表達，可合成生理需要量NO，eNOS在二聚體形態(tài)下將左旋精氨酸轉(zhuǎn)化為NO，NO是內(nèi)皮依賴性血管舒張的重要因子。NO由一氧化氮合成酶(NOS

7、)合成，eNOS在血管內(nèi)皮細胞中穩(wěn)定表達，可合成生理需要量NO，eNOS在二聚體形態(tài)下將左旋精氨酸轉(zhuǎn)化為NO，當eNOS解離為單體時則不能正常合成NO，而生成大量超氧陰離子O2-，O2-和NO反應生成大量ONOO-，對血管組織中的蛋白進行了氮化修飾，改變信號途徑，直接和間接介導NO的細胞毒性效應。目前研究中尚未探討減壓病中血管功能的損傷是否與eNOS解偶聯(lián)相關(guān)，本研究對其進行初步探討。
　　方法:
　　實驗動物選用SD大鼠，

8、隨機分為5組，(1)空白對照組:將30只大鼠置于0.3m3的加壓艙，用于小型動物復現(xiàn)DCS，不予加壓處理，停留65min，持續(xù)通入空氣，維持二氧化碳(CO2)水平低于300ppm，艙內(nèi)濕度維持于40％-60％，溫度維持27-30℃。大鼠在艙內(nèi)可自由活動并通過環(huán)閉路電視顯示、記錄系統(tǒng)，觀察大鼠艙內(nèi)行為。(2)模型組(DCS):將30只大鼠置于與對照組相同的加壓艙內(nèi)設置相同的溫度、濕度。以100kpa/min的速度加壓艙內(nèi)空氣至600kpa

9、(相當于60msw)維持60min，并持續(xù)通入空氣，維持CO2水平低于300ppm，并以相同速度減至常壓。(3)低劑量YFHXG組:DCS模型制作+YFHXG(0.165g/kg)，將30只大鼠按照劑量喂服益肺活血顆粒0.165g/kg，每日兩次，連續(xù)喂服，1周后將30只大鼠按照DCS組方式進行疾病模型制造。(4)中劑量YFHXG組:DCS模型制作+YFHXG(0.33g/kg)，將30只大鼠按照劑量喂服益肺活血顆粒0.33g/kg，每

10、日兩次，連續(xù)喂服，1周后將30只大鼠按照DCS組方式進行疾病模型制造。(5)高劑量YFHXG組:DCS模型制作+YFHXG(0.66g/kg)，將30只大鼠按照劑量喂服益肺活血顆粒0.66g/kg，每日兩次，連續(xù)喂服，1周后將30只大鼠按照DCS組方式進行疾病模型制造。
　　分別記錄每組大鼠患減壓病及死亡的數(shù)量，將每組存活大鼠行腹主動脈采血，采用流式細胞檢測法檢測每組大鼠血小板活化情況，放射免疫法檢測血清中6-keto-PGF(l

11、alpha)和TXB2水平，在麻醉下取存活大鼠肺組織，行肺免疫熒光染色，觀察血小板肺內(nèi)聚集情況，剝離肺動脈組織采用免疫熒光染色檢測組織因子在肺動脈內(nèi)的表達量。
　　將DCS組存活大鼠及對照組大鼠麻醉后剝離肺動脈，檢測離體肺動脈內(nèi)皮依賴的血管舒張力，采用western blot免疫印跡方法檢測肺動脈組織中內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)表達、解離情況以及肺動脈組織中各蛋白硝基化水平，行離體肺動脈超氧化物陰離子探針(DHE)染色檢測活

12、性氧ROS形成情況。
　　結(jié)果:
　　在血小板活化方面，空白組與DCS組及低、中、高劑量YFHXG組，DCS患病率及死亡率沒有差異(P＞0.05)。流式細胞顯示，與空白對照組比較，YFHXG組與DCS組血小板活化率明顯升高(P＜0.05);而與DCS組比較，YFHXG組血小板活化率有所減低，并且呈藥物濃度梯度減低(P＜0.05)。免疫熒光顯示:與對照組比較，DCS組與YFHXG組中肺組織血小板聚集明顯增加，并且益肺活血顆粒對

13、DCS引起的血小板聚集有抑制作用。放射免疫提示:與空白對照組比較，YFHXG組與DCS組大鼠血清中TXB2水平明顯升高，PGI2水平下降，TXB2/PGI2比值明顯升高(P＜0.05);而與DCS組比較，YFHXG組TXB2/PGI2比值有所減低，并且呈藥物濃度梯度減低(P＜0.05)。
　　在eNOS解偶聯(lián)方面，DCS組存活大鼠肺動脈內(nèi)皮依賴的血管舒張能力明顯下降;eNOS表達量:DCS組及對照組無明顯差異，但DCS組較對照組e

14、NOS單體/二聚體比例明顯升高;DCS組肺動脈組織各蛋白酪氨酸硝基化水平顯著高于對照組;DHE染色見DCS組肺動脈中ROS生成量明顯高于對照組。
　　結(jié)論:
　　通過上述實驗研究及結(jié)論，發(fā)現(xiàn)模擬潛艇逃生過程中不安全減壓致血管內(nèi)氣泡生成，導致減壓病發(fā)生。使大鼠肺動脈出現(xiàn)內(nèi)皮依賴血管舒張功能減弱，肺動脈中eNOS二聚體解離為單體，NO生成減少，ROS合成增加。同時DCS模型大鼠中出現(xiàn)大量血小板活化，TXB2/PGI2比值升高，肺

15、組織中出現(xiàn)大量血小板聚集，但肺動脈中組織因子表達無變化。同時益肺活血顆粒可抑制DCS模型大鼠血小板活化及肺內(nèi)聚集，并降低TXB2/PGI2比值。
　　通過本次研究我們得到以下結(jié)論:
　　(1)模擬潛艇逃生大鼠，可出現(xiàn)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙，其發(fā)生機制與eNOS解偶聯(lián)相關(guān);
　　(2)eNOS解偶聯(lián)可導致NO合成降低，血管舒張能力下降，同時可引起ROS合成增加，介導血管組織的超氧化損傷;
　　(3)模擬潛艇逃生