間歇性低氧對大鼠肺動脈ET-1敏感性及內(nèi)皮損傷性研究.pdf

1、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(Obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)是睡眠呼吸疾病中最為常見的一種，以睡眠中上氣道阻塞、頻繁出現(xiàn)呼吸不暢和呼吸中斷為特征。其人群發(fā)病率為2％-4％，為臨床常見疾病，可造成全身各個系統(tǒng)的綜合性損傷。OSAS病人引起周期性的動脈血氧飽和度波動，造成周期性間歇性低氧(cyclic intermittent hypoxia，CIH)。有研究指出，每天將大鼠置于間歇性低氧環(huán)境中數(shù)小

2、時，數(shù)周后可引起持續(xù)性肺動脈高壓以及肺血管重塑。間歇性低氧誘導(dǎo)肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)制還沒有完全明確，但相關(guān)研究證實(shí)在引起肺動脈高壓過程中某些潛在因素起到重要作用，其中涉及到對內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)敏感性增強(qiáng)、內(nèi)皮功能紊亂、血管活性物質(zhì)失衡等。
　　近年來的研究表明，肺動脈血管內(nèi)皮是一個代謝極為活躍的組織，合成和釋放多種血管活性物質(zhì)(ET-1、一氧化氮等)，共同調(diào)節(jié)血管壁的舒縮功能和平滑肌的增殖、遷移等。有研

3、究認(rèn)為，間歇性低氧可能會增加血漿ET-1水平、使內(nèi)皮功能異常、血管緊張度增加，從而誘導(dǎo)肺動脈高壓。本研究旨在利用CIH大鼠模型，通過觀察肺動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能以及對ET-1敏感性的改變，探討CIH對肺動脈內(nèi)皮功能的損傷。
　　目的：利用CIH大鼠模型，通過觀察肺動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能以及對ET-1敏感性的改變，探討CIH對肺動脈內(nèi)皮功能的損傷。
　　方法：清潔級雄性SD大鼠，體重180～190 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物中心

4、，在室溫20℃～22℃，空氣濕度45%～55％的條件下飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分成2組：正常氧組和CIH組。CIH組大鼠置于程序低氧艙內(nèi)，予以每天8h共21天的間歇低氧，程序設(shè)計每一低氧復(fù)氧循環(huán)時間為2min，前一分鐘充N2使氧濃度降至9％，后一分鐘充O2使氧濃度恢復(fù)到21％；對照組置于同樣的艙內(nèi)予以空氣供氣。21天后分別取各組大鼠肺動脈進(jìn)行檢測。(1)正常氧大鼠肺動脈環(huán)隨機(jī)分為內(nèi)皮完整組和去內(nèi)皮組，采用離體血管灌流技術(shù)，觀察CIH對ACh對P

5、E誘導(dǎo)收縮的舒張作用的影響；觀察ET-1對各組肺動脈環(huán)的收縮作用，以及ET受體阻斷劑對ET-1收縮作用的影響；觀察eNOS抑制劑L-NAME對ET-1誘導(dǎo)的各組肺動脈環(huán)收縮的影響。(2)組織學(xué)檢測：包括HE染色觀察肺動脈的組織病理學(xué)變化和透射電鏡觀察肺動脈超微結(jié)構(gòu)的病理學(xué)變化。(3)RT-PCR測定ET-1，ETA受體以及ETB受體mRNA的表達(dá)。(4)免疫組織化學(xué)法觀察ET-1、ETA受體和ETB受體的表達(dá)分布。(5)Western

6、Blotting測定eNOS蛋白的表達(dá)。(6)酶轉(zhuǎn)化法測定肺動脈組織中NO的含量。
　　結(jié)果：
　　1、CIH對肺動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響
　　CIH肺動脈環(huán)ACh對PE預(yù)收縮產(chǎn)生的舒張效應(yīng)(53.3±4.31％，n=6)明顯低于正常氧內(nèi)皮完整組(93.3±4.30％，n=6，P<0.01)，明顯高于正常氧去內(nèi)皮組(3.03±2.52％，n=6，P<0.01)。
　　2、 CIH對ET-1誘導(dǎo)肺動脈收縮的影響

7、
　　大鼠肺動脈對ET-1誘導(dǎo)的收縮呈劑量依賴性增強(qiáng)，與正常氧內(nèi)皮完整肺動脈環(huán)(EC50=0.718±0.008 nM，n=4)相比，去除內(nèi)皮(EC50=0.493±0.004 nM，n=4，P<0.01)和CIH(EC50=0.575±0.003 nM，n=4，P<0.01)均能使肺動脈對ET-1的敏感性增強(qiáng)，但與CIH大鼠相比，去內(nèi)皮組肺動脈環(huán)對ET-1誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)更敏感(P<0.01)。
　　3、 ET受體阻斷劑對E

8、T-1誘導(dǎo)各組肺動脈環(huán)收縮作用的影響
　　對于不同組的大鼠肺動脈環(huán)，BQ123(ETA受體阻斷劑)幾乎均能完全阻斷ET-1誘導(dǎo)的肺動脈收縮。
　　正常氧內(nèi)皮完整的大鼠肺動脈，BQ788(ETB受體阻斷劑)部分抑制ET-1誘導(dǎo)的收縮(44.13±7.04％，n=6)，去除內(nèi)皮后，收縮率明顯加強(qiáng)(72.59±5.17％，n=6，P<0.01)，對于CIH大鼠的肺動脈環(huán)(52.79±1.95％，n=6)，BQ788對ET-1誘導(dǎo)的

9、收縮抑制作用明顯低于正常氧內(nèi)皮完整組(P<0.01)，明顯高于去內(nèi)皮組(P<0.01)。
　　4、 eNOS抑制劑L-NAME對ET-1誘導(dǎo)血管收縮的影響
　　在正常氧內(nèi)皮完整的情況下，L-NAME可顯著加強(qiáng)ET-1誘導(dǎo)的收縮(115.68±7.13％，n=6)，去除內(nèi)皮后，L-NAME對ET-1誘導(dǎo)的收縮基本無影響(100.83±6.61％，n=6)，明顯低于內(nèi)皮完整組(P<0.01)；間歇性低氧后，L-NAME對ET-1

10、誘導(dǎo)的收縮產(chǎn)生抑制作用(79.72±8.33％，n=6)。
　　5、 CIH對肺動脈結(jié)構(gòu)的影響
　　HE染色觀察正常氧大鼠肺動脈，內(nèi)皮層完整，內(nèi)皮細(xì)胞排列規(guī)則，電鏡下看到正常的線粒體；經(jīng)過CIH處理后的大鼠肺動脈，內(nèi)皮層觀察到病理學(xué)變化，血管內(nèi)皮細(xì)胞核水腫，局部內(nèi)皮細(xì)胞脫落，電鏡下內(nèi)皮細(xì)胞部分線粒體嵴破壞。
　　6、 CIH對大鼠肺動脈ET-1、ETA受體和ETB受體mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)的影響
　　與正常氧大鼠

11、相比，CIH大鼠肺動脈ET-1和ETA受體mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)，ETB受體mRNA表達(dá)卻明顯降低(P<0.01)。免疫組織化學(xué)分析其蛋白定位發(fā)現(xiàn)，CIH處理后，大鼠肺動脈內(nèi)皮層和平滑肌層均有ET-1表達(dá)的增多，ETA受體主要集中在平滑肌層表達(dá)，并且CIH使血管平滑肌層ETA受體表達(dá)增多，ETB受體在平滑肌層和內(nèi)皮層均有分布，并且CIH后，ETB受體在平滑肌和內(nèi)皮層的表達(dá)均有減少。
　　7 CIH對大鼠肺動脈組織NO