線粒體內(nèi)膜ATP敏感性鉀通道在慢性間歇性低壓低氧預(yù)處理對腦缺血耐受的誘導(dǎo)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、腦缺血是以腦循環(huán)血流量減少為特征的腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率的特點(diǎn)，已成為全球性的健康問題。而缺血性腦卒中約占腦卒中的70％-80%，不容忽視。我國衛(wèi)生部2011年發(fā)布的《中國卒中宣言》指出，腦卒中已經(jīng)成為我國第一大致死疾病，發(fā)病率高居世界首位。在我國，每年用于腦卒中患者的醫(yī)藥費(fèi)和護(hù)理費(fèi)等開支巨大，給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也給臨床護(hù)理人員帶來了繁重的護(hù)理負(fù)擔(dān)。因此，腦缺血的預(yù)防顯得尤為重要，腦缺血一級預(yù)防

2、的意義遠(yuǎn)大于二級和三級預(yù)防，即在尚未出現(xiàn)卒中或有危險因素時即給予干預(yù)和護(hù)理，降低卒中風(fēng)險，提高機(jī)體自身抵抗能力，以達(dá)到避免或減少卒中的損害嚴(yán)重程度的目的。目前亟需安全有效的一級預(yù)防措施。
　　慢性間歇性低壓低氧（CIHH）對機(jī)體具有多種有益效應(yīng)，長時間以來都被用于一些疾病的預(yù)防和治療，但其可否用于預(yù)防腦卒中及其相關(guān)機(jī)制還待進(jìn)一步研究。近年，線粒體作為腦缺血性損傷的亞細(xì)胞靶目標(biāo)，在腦保護(hù)中的作用越來越受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血預(yù)處理

3、與線粒體內(nèi)膜ATP敏感性鉀通道（mitoKATP）有關(guān)，應(yīng)用mitoKATP的阻斷劑5-羥基癸酸鹽（5-HD）可以阻斷腦缺血耐受，提示mitoKATP可能也參與了腦缺血耐受的形成，但mitoKATP在CIHH誘導(dǎo)腦缺血耐受過程中的作用還不十分清楚。
　　目的：建立大鼠全腦缺血模型，明確CIHH可以誘導(dǎo)腦缺血耐受，并探討mitoKATP通道在其中的作用及其可能機(jī)制。
　　方法：健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為以下7組：（1）對

4、照組（Control組）：不接受任何處理；（2）假手術(shù)組（Sham組）：永久凝閉雙側(cè)椎動脈，2 d后游離雙側(cè)頸總動脈，但不夾閉；（3）慢性間歇性低壓低氧組（CIHH組）：大鼠接受模擬5000米海拔低壓低氧環(huán)境，每天6小時，持續(xù)28天的CIHH適應(yīng)處理；（4）腦缺血組（ISH組）：永久凝閉雙側(cè)椎動脈，2 d后夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min致全腦缺血；（5）慢性間歇性低壓低氧+腦缺血組（CIHH+ISH組）：大鼠接受模擬5000米海拔低壓低氧環(huán)

5、境，每天6小時，持續(xù)28天的CIHH適應(yīng)處理后，永久凝閉雙側(cè)椎動脈，2 d后夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min致全腦缺血；（6）缺血前30分鐘給予5-HD腹腔注射（40 mg/kg），其余實驗步驟同第5組；（7）5-羥基癸酸鹽+假手術(shù)組（5-HD+Sham組）：永久凝閉雙側(cè)椎動脈，2 d后游離雙側(cè)頸總動脈前30分鐘給予5-HD腹腔注射（40 mg/kg），但不夾閉頸總動脈。
　　實驗觀察內(nèi)容包括如下步驟：（1）實驗動物于造模完成后30天開

6、始采用Morris水迷宮實驗（MWM）觀測各組實驗動物學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)功能，在行為學(xué)實驗結(jié)束后，取海馬行硫堇染色觀察CA1區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性壞死（DND）情況。（2） CIHH預(yù)處理結(jié)束后0 h，6 h，1 d，3 d，7 d和10 d等各時間點(diǎn)海馬CA1區(qū)mitoKATP的亞基Kir6.2，SUR1的蛋白的動態(tài)表達(dá)。（3）mitoKATP的亞基Kir6.2，SUR1于缺血后2 d和7 d時在海馬CA1區(qū)不同組間的蛋白表達(dá)比較；（4）在缺

7、血后1 d時（其他各組在相應(yīng)時間點(diǎn)），取海馬CA1區(qū)，采用western blot技術(shù)分別觀察Cytochrome c在線粒體和胞漿中的蛋白表達(dá)情況，來比較CIHH預(yù)處理是否抑制了缺血所引起的凋亡；（5）在缺血后1 d時（其他各組在相應(yīng)時間點(diǎn)），取海馬CA1區(qū)，采用流式細(xì)胞技術(shù)觀察各組神經(jīng)元線粒體膜電位（ΔΨm）的變化，通過使用5-HD來驗證CIHH預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受是否由mitoKATP介導(dǎo)；（6）在缺血后3 d時（其他各組在相應(yīng)

8、時間點(diǎn)），取海馬CA1區(qū)組織，采用透射電鏡觀察不同處理組椎體神經(jīng)元及線粒體超微結(jié)構(gòu)。
　　統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean± SD）表示，應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各時間點(diǎn)兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗，多組之間的兩兩比較采用多樣本方差分析， HG采用Kruska-Wallis法進(jìn)行多樣本等級資料的秩和檢驗，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.在水迷宮的尋臺潛

9、伏期實驗中，各組大鼠隨著訓(xùn)練增加，逃避潛伏期均呈現(xiàn)出逐漸縮短的趨勢。Sham組和CIHH組大鼠相比，逃避潛伏期無顯著性差異；在第4天時，ISH組大鼠的逃避潛伏期比Sham組明顯延長；CIHH+ISH組的逃避潛伏期跟ISH組相比又出現(xiàn)了縮短了；5-HD+CIHH+ISH組的逃避潛伏期比CIHH+ISH組延長，5-HD+Sham組和Sham組無顯著差異。在空間探索實驗中，Sham組和CIHH組在原平臺所在象限停留時間占總時間百分比無差異；I

10、SH組在目標(biāo)象限的停留時間百分比與Sham組相比明顯減少；然而CIHH+ISH組與ISH組相比，在目標(biāo)象限的停留時間百分比明顯增加；當(dāng)提前應(yīng)用了5-HD阻斷mitoKATP后，在目標(biāo)象限的停留時間百分比又減少至接近ISH組水平；5-HD+Sham組和Sham組無顯著差異。
　　2.硫堇染色顯示，Sham組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、致密，約2-3層，細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，邊界清晰，尼氏小體豐富，胞核大且圓、核仁清晰可見。CIHH組

11、大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元未見明顯損失，與Sham組相比，無明顯變化。ISH組大鼠海馬CA1區(qū)可見神經(jīng)元幾乎全部死亡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞體縮小，形態(tài)不規(guī)則，呈多角形或梭型，胞膜皺縮，胞核固縮，核仁模糊不清甚至消失； CIHH+ISH組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、致密，胞核飽滿，核仁較清晰，僅有個別胞核固縮，無明顯細(xì)胞缺失。應(yīng)用5-HD后，組織學(xué)表現(xiàn)又接近ISH組。5-HD+Sham組和Sham組無顯著差異。
　　3.與C

12、on組相比，CIHH處理28天后0h，6 h，1 d，3 d，7 d mitoKATP的兩個亞基Kir6.2和SUR1的蛋白表達(dá)均顯著增高，CIHH后10d無明顯差異。
　　4.CIHH處理28天后2天或7天，與Sham組相比，CIHH組mitoKATP的兩個亞基Kir6.2和SUR1的蛋白表達(dá)顯著增高，與ISH組相比，CIHH+ISH組線粒體亞基Kir6.2和SUR1的蛋白表達(dá)顯著增高。
　　5.與Sham組相比，CIHH

13、組大鼠海馬組織胞漿內(nèi) Cytochrome c明顯減少，與ISH組大鼠相比，CIHH+ISH組大鼠胞漿內(nèi)Cytochrome c明顯減少，與CIHH+ISH組大鼠相比，5-HD+CIHH+ISH組大鼠胞漿內(nèi) Cytochrome c明顯增多，而線粒體內(nèi)的Cytochrome c的變化與胞漿內(nèi)相反。
　　6.與Sham組相比，ISH組ΔΨm的水平顯著降低，與ISH組相比， CIHH+ISH組能明顯抑制ΔΨm的水平的降低，保持ΔΨm水

14、平的穩(wěn)定，與CIHH+ISH組相比，5-HD+CIHH+ISH組ΔΨm水平明顯降低，說明5-HD取消了CIHH對ΔΨm水平降低的抑制作用。
　　7.與Sham組相比，CIHH組無明顯變化，ISH組中線粒體的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為廣泛的空泡化、嚴(yán)重的嵴斷裂以及伴有膜破壞；而CIHH+ISH組可部分改善線粒體的結(jié)構(gòu)變化，5-HD+CIHH+ISH組與CIHH+ISH相比，其線粒體又出現(xiàn)了明顯損傷，其表現(xiàn)與ISH組的線粒體超微結(jié)構(gòu)

15、相似。
　　結(jié)論：
　　1.CIHH預(yù)處理可以誘導(dǎo)腦缺血耐受，減輕缺血造成的神經(jīng)元遲發(fā)性壞死、線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷以及學(xué)習(xí)記憶的損傷。
　　2.CIHH預(yù)處理上調(diào)了海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的mitoKATP的兩個亞基Kir6.2和SUR1的表達(dá)，并且對抗了腦缺血所致的兩個亞基表達(dá)的降低。
　　3.CIHH可以對抗腦缺血時線粒體膜電位的下降和線粒體凋亡的啟動蛋白Cytochrome c的外流。
　　4.通過使用5-