慢性間歇性低壓低氧對癲癇大鼠的腦保護作用和機制探討.pdf

1、癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)綜合征。國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國目前約有900多萬癲癇患者，其中25％-40％為難治性癲癇，顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是最常見的難治性癲癇類型，主要特點是逐漸進展的原發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作（spontaneous recurrent epileptic seizure，SRS）和海馬硬化，伴有明顯的藥物抵抗性。臨床調(diào)查表明，超過一半的癲癇患者具有不同程度的認知功能障礙，有的因

2、癲癇發(fā)作頻繁不能堅持服藥，有的因長期服用抗癲癇藥物（藥物本身可致不同程度的認知功能障礙）所致，這無疑給個人、家庭及社會帶來了沉重的負擔(dān)。
　　匹魯卡品(pilocarpine，PILO)致癇大鼠的行為學(xué)、海馬神經(jīng)元損傷的病理形態(tài)學(xué)及神經(jīng)電生理學(xué)等改變均與人類的TLE相似，因此該模型是目前研究癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）和TLE的經(jīng)典模型之一。
　　SE的致病機制較為復(fù)雜，目前尚未完全闡明，主要包

3、括:苔蘚纖維芽生假說;Ca2+內(nèi)流引發(fā)的細胞毒性;谷氨酸和γ-氨基丁酸及其受體結(jié)構(gòu)和功能異常;氧化應(yīng)激損傷及凋亡等。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增多或體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，體內(nèi)氧自由基代謝就會失衡，蓄積過多的ROS易導(dǎo)致組織受損。ROS通過直接或間接氧化損傷DNA、誘發(fā)基因突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化，激活非選擇性鈣通道，調(diào)節(jié)細胞凋亡相關(guān)基因，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡。另外，S

4、E時常伴嚴重的缺氧，易致ROS的增加，而ROS也可直接或間接堆積于線粒體，損傷線粒體膜，降低膜電位，造成線粒體的結(jié)構(gòu)和功能異常，使線粒體內(nèi)的細胞色素C(Cytochrome c)釋放入細胞質(zhì)，引發(fā)caspase級聯(lián)效應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡。因此，對如何減少氧化應(yīng)激ROS的產(chǎn)生、保護線粒體并抑制細胞凋亡具有重要的研究意義，探索難治性癲癇的替代治療或輔助治療措施便成為當(dāng)務(wù)之急。
　　目前已發(fā)現(xiàn)多種預(yù)處理方法可以誘導(dǎo)組織細胞對缺氧產(chǎn)生耐受，包

5、括缺血、高壓氧、高溫、低溫、睡眠剝奪等，這些方法由于本身存在明顯的副作用，在臨床實際應(yīng)用方面受到限制。眾所周知，低氧容易改變機體的生理功能，嚴重的低氧往往引起的是一種損傷的病理改變，而最近研究發(fā)現(xiàn)適度的低氧預(yù)處理對機體則起到一定的保護效應(yīng)。
　　研究已證實，低氧預(yù)處理可通過抑制腫瘤壞死因子α、上調(diào)促紅細胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子及Bcl-2抗凋亡蛋白等在海馬CA1和CA3區(qū)的表達，改善腦缺血缺氧后腦組織的損傷及其導(dǎo)致的認知功能障礙

6、。越來越多的研究報道，慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobarichypoxia，CIHH)對機體多種組織、器官均有明顯的保護作用，例如增強機體對缺血缺氧的耐受性，對抗缺血/再灌注所致的心臟功能損傷、抑制心肌超微結(jié)構(gòu)受損及鈣離子超載、保持鈣穩(wěn)態(tài)，并能夠有效抗心律失常，保護神經(jīng)、肝臟、腎臟等組織器官;而且CIHH還具有降壓、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、增強免疫功能等作用。在缺血性腦血管病方面的研究中，CIHH通

7、過上調(diào)大鼠腦內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1（glutamate transporter-1，GLT-1）誘導(dǎo)其產(chǎn)生缺氧耐受性。而CIHH預(yù)處理是否對癲癇也具有一定的腦保護作用？目前尚未見報道。有鑒于此，本實驗通過制備氯化鋰-匹魯卡品誘導(dǎo)的SE大鼠模型，觀察CIHH對致癇大鼠的行為學(xué)、腦組織形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)等方面的影響，評價CIHH預(yù)處理的保護作用并進一步探討其可能的作用機制，為此主要致力于以下四個部分的研究:
　　第一部分、CIHH預(yù)處理

8、對匹魯卡品致癇大鼠的腦保護效應(yīng)
　　目的:建立匹魯卡品（pilocarpine，PILO）誘導(dǎo)的SE大鼠模型，研究CIHH預(yù)處理對PILO致癇大鼠的腦損傷是否具有保護作用，分別從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)等方面進行評價，并初步探討其作用機制。
　　方法:
　?。▽嶒炓唬⒊赡杲】敌坌許prague-Dawley(SD)大鼠隨機分為6組:正常對照組（CON組）和PILO模型組（SE組），根據(jù)SE發(fā)作后不同的時間點分為SE

9、3h、 SE12h、SE24h、SE72h和 SE7d五個亞組,每組各10只。應(yīng)用Nissl染色法和流式細胞儀動態(tài)觀察SE后不同時間點大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡情況，檢測該模型制備是否成功。
　?。▽嶒灦└鶕?jù)目前文獻報道:SE后腦組織損傷程度最嚴重的時間多為發(fā)作后72h，我們選取SE72h進行研究，將動物隨機分為4組:CON組(n=7)，SE組(n=13)，CIHH+SE組(n=13)，CIHH組(n=7)。利用腦電圖觀察大鼠的癇性發(fā)

10、作潛伏期和癲癇波發(fā)放的頻率，并記錄死亡率;對腦組織一部分行Nissl染色計數(shù)海馬組織中存活的神經(jīng)元;另一部分應(yīng)用流式細胞儀定量分析海馬神經(jīng)元的凋亡情況。
　　結(jié)果:
　?。▽嶒炓唬?br>　　1.50只大鼠中，41只被誘發(fā)SE，成功率為82％，實驗過程中共死亡9只（包括誘發(fā)SE成功后的7只），最終可納入實驗的大鼠共34只。CON組無大鼠死亡，10只均可納入實驗。
　　2.Nissl染色:CON組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3

11、區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，無神經(jīng)元丟失;SE3h組和SE12h組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)結(jié)構(gòu)相對完整，未見到明顯的神經(jīng)元丟失;SE24h組可見大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元部分丟失;SE72h組神經(jīng)元丟失明顯，且CA1區(qū)更嚴重。而SE7d組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的丟失較SE72h組有所減少。
　　與CON組相比，SE3h組、SE12h組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量幾乎無減少(P＞0.05);SE24h組、SE72h組和SE7d組大

12、鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少(P＜0.05)。與SE72h組相比，其它組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量均明顯增加（P＜0.05）。
　　3.細胞凋亡率:與CON組相比，SE3h組、SE12h組的海馬細胞凋亡率均無明顯增加(P＞0.05)，而SE24h組、SE72h組和SE7d的細胞凋亡率有不同程度的增加(P＜0.05)。與SE72h組相比，SE24h組和SE7d組海馬細胞的凋亡率均有所下降（P＜0.05），

13、但后兩者間無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與Nissl染色及以往的文獻報道結(jié)果一致，證明本實驗?zāi)Ｐ椭苽涫浅晒Φ?、可行的?br>　?。▽嶒灦?br>　　1.SE組、CIHH+SE組大鼠的死亡率分別為23.1％和0％。與SE組相比，CIHH+SE組的潛伏期延長（33.9±2.3min vs.24.5±1.7min，P＜0.05）;癲癇波發(fā)放的頻率更少（100.5±2.9HZ vs.118.3±4.0HZ，P＜0.05）。CON組和C

14、IHH預(yù)處理組中大鼠均無SE發(fā)作及死亡。
　　2.Nissl染色:CON組大鼠的海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，幾乎無神經(jīng)元丟失。與CON組相比，SE組大鼠神經(jīng)元丟失明顯;CIHH+SE組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)部分完整，尼氏小體數(shù)量較SE組顯著增加。CIHH組大鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對完整，偶見神經(jīng)元丟失。
　　海馬神經(jīng)元存活數(shù):與CON組相比，SE組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少(P＜0.05);經(jīng)CIHH預(yù)處理

15、后明顯增加了神經(jīng)元的存活數(shù)量(P＜0.05)。單純行CIHH預(yù)處理組存活的神經(jīng)元數(shù)量雖然少于CON組，但兩者間無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3.細胞凋亡率:與CON組相比，SE組和CIHH+SE組的海馬細胞凋亡率均明顯增加(P＜0.05);單純行CIHH組細胞凋亡率雖然稍高于CON組，但兩者無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與SE組相比，CIHH+SE組的細胞凋亡率明顯減低(P＜0.05)。
　　結(jié)論: PIL

16、O誘導(dǎo)的SE大鼠模型能較好的動態(tài)觀察腦損傷后神經(jīng)元凋亡情況。SE發(fā)作后72h時，海馬組織CA1區(qū)損傷最為嚴重;CIHH預(yù)處理可能通過延長SE大鼠的腦電圖癇性放電潛伏期、降低癇性波發(fā)放頻率來抑制癲癇發(fā)作，降低海馬神經(jīng)元的凋亡率。
　　第二部分、不同的低氧預(yù)處理對匹魯卡品致癇大鼠的海馬損傷作用
　　目的:已有研究表明，慢性間歇性常壓低氧(chronic intermittentnormobaric hypoxia，CINH)對大

17、鼠的腦組織損傷發(fā)揮著一定的保護作用。本研究分別從PILO誘導(dǎo)的SE大鼠的SRS、胞漿內(nèi)鈣離子濃度及細胞凋亡率等方面比較兩種不同的預(yù)處理方式（CIHH和CINH）對大鼠海馬損傷的保護作用。
　　方法:將成年雄性SD大鼠隨機分為4組:正常對照組(CON組，n=18)，PILO模型組（SE組，n=34），CIHH預(yù)處理+SE組（CIHH-Pre組，n=24）和CINH預(yù)處理+SE組（CINH-Pre組，n=24）。將每組大鼠分為兩部分:

18、一部分應(yīng)用視頻腦電圖(V-EEG)觀察大鼠SE后自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作(SRS)情況（包括SRS的頻率、發(fā)作級別及持續(xù)時間）;另一部分于SE72h時分別應(yīng)用Nissl和FJB染色法觀察大鼠海馬的神經(jīng)元凋亡和變性情況;流式細胞儀檢測海馬胞漿內(nèi)鈣離子濃度（[Ca2+]i)和細胞凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1.PILO誘導(dǎo)的SE大鼠死亡率為47.1％，而CIHH-Pre組和CINH-Pre組SE大鼠的死亡率分別為16.7％和20.8％。

19、
　　V-EEG記錄SRS的情況:CIHH-Pre組和CINH-Pre組出現(xiàn)SRS的頻率、嚴重程度和持續(xù)時間均較SE組明顯降低(P＜0.05)。與CINH-Pre組相比，CIHH-Pre組出現(xiàn)SRS的頻率更少（P＜0.05），發(fā)作級別更低(P＜0.05)。CON組大鼠無SRS發(fā)作和死亡。
　　2.與CON組相比，SE組海馬胞漿內(nèi)[Ca2+]i明顯升高（2.16±0.06 vs.1.19±0.03，P＜0.05）。與SE組相比

20、，CIHH-Pre組大鼠海馬胞漿內(nèi)[Ca2+]i（1.51±0.03）和CINH-Pre組(1.7釷0.03)均明顯的降低（P＜0.05）;且CIHH-Pre組海馬胞漿內(nèi)[Ca2+]i低于CINH-Pre組(P＜0.05)。
　　3.與CON組相比，SE組大鼠海馬的神經(jīng)元丟失明顯;而CIHH-Pre組和CINH-Pre組神經(jīng)元丟失的程度較SE組減輕。SE組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的存活神經(jīng)元數(shù)量均較CON組明顯減少（P＜0.05

21、）。與SE組相比，CIHH-Pre組和CINH-Pre組均明顯地增加了大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量(P＜0.05);而CINH-Pre組CA1區(qū)的存活神經(jīng)元數(shù)量仍低于CIHH-Pre組(55.00±1.07 vs.74.83±1.40,P＜0.05)。
　　4.CON組未見明顯的FJB陽性細胞。與CON組相比，PILO誘導(dǎo)的SE組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)可見呈黃綠色熒光的FJB陽性細胞明顯增多。CIHH-Pre組和CINH

22、-Pre組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)均明顯減少了FJB陽性細胞（P＜0.05），且CIHH-Pre組CA1區(qū)的FJB陽性細胞數(shù)少于CINH-Pre組(P＜0.05)。
　　5.PILO誘導(dǎo)的SE組大鼠海馬細胞早期凋亡率(Q4)和總的凋亡率(Q2+Q4)均明顯高于CON組(P＜0.05)。與SE組相比，CIHH-Pre組和CINH-Pre組均明顯地降低了海馬細胞的凋亡率（P＜0.05），且CIHH-Pre組的凋亡率低于CINH-Pr

23、e組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:PILO誘導(dǎo)的SE大鼠容易出現(xiàn)SRS行為，使海馬組織細胞內(nèi)[Ca2+]i升高，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。CIHH和CINH預(yù)處理均可通過有效地抑制SE大鼠的SRS行為和胞漿內(nèi)鈣離子超載來營救損傷的海馬神經(jīng)元，且CIHH預(yù)處理措施可能更有效。
　　第三部分、CIHH對匹魯卡品致癇大鼠的海馬抗氧化防御體系的影響
　　目的:研究CIHH預(yù)處理是否對癲癇發(fā)作產(chǎn)生的氧化應(yīng)激及線粒體損傷具有一定的保護作用，

24、并探討可能的作用機制。
　　方法:將成年雄性SD大鼠隨機分為3組:正常對照組（CON組），PILO模型組（SE組）和CIHH預(yù)處理+SE組（CIHH+SE組），每組各20只。于SE發(fā)作后72h時，首先制作大鼠海馬組織的勻漿液，根據(jù)試劑盒說明分別檢測MDA含量、總SOD、SOD1、SOD2及GSH的活力;然后應(yīng)用流式細胞儀檢測海馬組織細胞內(nèi)ROS、線粒體膜電位（mitochondrial transmembranepotential

25、，△Ψm）的水平;Western Blot檢測胞漿中Cytochrome c、Caspase3、Bcl-2、Bax蛋白的表達;并結(jié)合透射電鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:
　　1.與CON組相比，SE組大鼠海馬內(nèi)MDA的水平明顯升高（P＜0.05）;總的SOD和SOD2的活力均明顯降低（P＜0.05），GSH的含量也明顯降低(P＜0.05)，而CIHH+SE組可不同程度地逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)的異常改變(P＜0.05)。SOD1在

26、各實驗組間則無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.與SE組相比，CIHH+SE組能明顯降低海馬細胞內(nèi)ROS的水平(P＜0.05)，明顯升高△Ψ的水平（P＜0.05）。
　　3.與CON組相比，SE組大鼠海馬組織胞漿內(nèi)Cytochrome c，Caspase3，Bax，及Bax/Bcl-2蛋白的水平均明顯升高（P＜0.05），而Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。CIHH預(yù)處理后均可不同程度地逆轉(zhuǎn)上述蛋白的表達水平（P

27、＜0.05）。
　　4.與CON組相比，SE組中線粒體的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為廣泛的空泡化、嚴重的嵴斷裂伴膜破壞;而CIHH+SE組可部分改善線粒體的結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)論:SE發(fā)作后線粒體可能是自由基攻擊的靶點。CIHH預(yù)處理可通過增強大鼠海馬組織的抗氧化應(yīng)激能力，改善線粒體的結(jié)構(gòu)和功能來發(fā)揮神經(jīng)元的保護作用。
　　第四部分、CIHH對匹魯卡品致癇大鼠認知功能的改善作用和機制探討
　　目的:研究CIHH預(yù)處

28、理對SE大鼠的認知功能障礙、海馬組織中突觸的超微結(jié)構(gòu)和突觸相關(guān)蛋白的表達有何影響，進一步探討相關(guān)的作用機制。
　　方法:將成年雄性SD大鼠隨機分為3組:正常對照組（CON組，n=10）和PILO模型組(SE組，n=20)和CIHH預(yù)處理+SE組（CIHH+SE組，n=20）。根據(jù)文獻報道及我們前期的實驗結(jié)果表明:SE發(fā)作后多于14-42d出現(xiàn)SRS行為，由此我們選取SE發(fā)作后42d時，進行Morris水迷宮行認知功能檢測;結(jié)束后分

29、別應(yīng)用透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)突觸的超微結(jié)構(gòu);WesternBlot法檢測胞漿中PSD-95和Kalirin-7蛋白的表達。
　　結(jié)果:由于大鼠經(jīng)SE發(fā)作后部分出現(xiàn)死亡，本部分實驗中SE發(fā)作后42d時，各組大鼠的存活情況:CON組10只，PILO誘導(dǎo)的SE組9只，CIHH+SE組14只。
　　1.水迷宮檢測:隨著訓(xùn)練時間的延長，從第3d開始，各組大鼠尋找平臺的潛伏期均逐漸縮短（P＜0.05）。CIHH預(yù)處理組較SE組的潛伏期

30、明顯縮短（P＜0.05）。在空間探索試驗中，與CON組相比，SE組大鼠的穿臺次數(shù)明顯減低（5.33±0.58 vs.11.8±0.76，P＜0.05），在目標(biāo)象限停留時間也明顯縮短（52.78±2.00s vs.86.80±1.67s，P＜0.05）;而CIHH+SE組大鼠的穿臺次數(shù)（7.86±0.44）較SE組有所增加（P＜0.05），在目標(biāo)象限停留時間(67.36±2.06s)也明顯延長(P＜0.05)。在可視平臺試驗中，各組間大鼠

31、的逃避潛伏期和游泳速度均無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2.突觸間隙寬度:與CON組相比（20.27±0.45nm），SE組和CIHH+SE組大鼠海馬的突觸間隙均顯著增寬（P＜0.05）。雖然CIHH+SE組的突觸間隙較SE縮窄，但兩者無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(23.13±0.89nm vs.25.20±0.78nm，P＞0.05)。
　　突觸后致密物厚度:與CON組相比（30.27±0.69nm），SE組和CIHH+S

32、E組大鼠海馬的突觸后致密物厚度均顯著降低（P＜0.05）;而CIHH+SE組較SE組明顯增加（27.87±0.77nm vs.22.67±0.76nm，P＜0.05）。
　　3.PSD-95蛋白:與CON組相比（0.72±0.02），SE組和CIHH+SE組中大鼠海馬的胞漿內(nèi)PSD-95蛋白的表達水平均顯著降低(P＜0.05);而CIHH+SE組中表達的水平明顯高于SE組(0.40±0.02 vs.0.21±0.02，P＜0.05

33、)。
　　Kalirin-7蛋白:與CON組相比(0.68±0.02)，SE組和CIHH+SE組中大鼠海馬胞漿內(nèi)Kalirin-7蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）;而CIHH+SE組的表達水平高于SE組(0.34±0.02 vs.0.26±0.02,P＜0.05)。
　　結(jié)論: PILO誘導(dǎo)的SE大鼠長期反復(fù)發(fā)作可出現(xiàn)明顯的認知功能障礙和海馬突觸結(jié)構(gòu)的損傷。CIHH預(yù)處理可有效改善受損的突觸超微結(jié)構(gòu)并上調(diào)突觸相關(guān)蛋白的表達