慢性間歇性低壓低氧對代謝綜合征大鼠血管內(nèi)皮保護(hù)作用及機(jī)制的研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代社會物質(zhì)生活水平的提高和生活模式的改變,世界范圍肥胖人口的比例在快速升高。世界衛(wèi)生組織(WHO)日前公布，截止到2013年，全世界有超過21億人超重或肥胖，其中美國占全球肥胖者的13％，而我國和印度共同占總數(shù)的15％。肥胖及其引發(fā)的相關(guān)疾病也越來越受到公眾和社會注意。以肥胖、高血脂、動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等為組成的代謝綜合征已成為首要危害人民健康的一組疾病。最早期相關(guān)血管功能的異常是內(nèi)皮功能障礙，主要表現(xiàn)為血管對縮血管物質(zhì)

2、的反應(yīng)性增加，對舒血管物質(zhì)的反應(yīng)性降低。
　　內(nèi)皮功能障礙的誘發(fā)因素主要包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)過度激活、缺氧/復(fù)氧損傷、缺血/再灌注損傷、胰島素抵抗、炎癥/免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulumstress，ERS)等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、折疊和成熟的主要部位，其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是實現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的基本條件。ERS是指蛋白質(zhì)折疊、捕獲和降解的破壞，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的積累。高脂可引發(fā)肥胖動物內(nèi)質(zhì)

3、網(wǎng)中蛋白質(zhì)合成速度過快以至于超過蛋白質(zhì)折疊能力，導(dǎo)致未折疊和錯誤折疊蛋白的積累，表現(xiàn)ERS。而ERS又可激活炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝臟和脂肪組織的胰島素抵抗，引發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙和動脈粥樣硬化。
　　自噬是一種溶酶體相關(guān)的降解蛋白質(zhì)和回收細(xì)胞器的重要細(xì)胞過程，與ERS之間存在互為因果的功能性耦合。ERS作為自噬反應(yīng)的刺激者，為細(xì)胞在不利環(huán)境下存活而激活自噬，去除功能失調(diào)或損壞的細(xì)胞器，減輕ERS以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動態(tài)平衡，從而保護(hù)生命體。因此，

4、自噬是蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和抗氧化應(yīng)激的重要機(jī)制之一。自噬流指整個自噬的動態(tài)過程，是評價自噬功能的重要指標(biāo)。自噬體的形成及其在溶酶體內(nèi)的降解是自噬流的兩大關(guān)鍵部分。自噬功能的缺損或障礙，會加重氧化應(yīng)激和ERS，參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展，包括脂質(zhì)代謝異常、神經(jīng)變性、腫瘤、衰老及缺血再灌注損傷等心臟相關(guān)疾病。高脂飲食喂養(yǎng)的動物，由于自噬流改變，導(dǎo)致外周組織對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙和ERS，發(fā)展為肥胖。與之對應(yīng)的是，肥胖動物的自噬功能障礙，表現(xiàn)為氧化應(yīng)激、E

5、RS和NO生物利用度受損，減弱內(nèi)皮細(xì)胞抗動脈粥樣硬化的保護(hù)功能。
　　自噬接受眾多分子信號途徑調(diào)控，其中腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine mono-phosphate activated protein kinase，AMPK)既作為上游能量傳感器，又作為下游自噬活化劑，特別是在糖尿病等內(nèi)分泌紊亂疾病中發(fā)揮重要作用。AMPK主要通過抑制mTOR復(fù)合物和磷酸化ULK1，觸發(fā)自噬兩個下游信號分子S6K1和4E-BP1，以TSC1

6、/2依賴性或非依賴性機(jī)制，在能量平衡和代謝應(yīng)激中正向調(diào)節(jié)自噬。
　　我室以往研究表明，慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia，CIHH)對機(jī)體多種組織具有保護(hù)作用。在心臟方面，可促進(jìn)缺血/再灌注心臟功能的恢復(fù)、縮小梗死面積和抗心律失常；在肝臟方面，可降低代謝綜合征大鼠ERS介導(dǎo)的肝臟損傷，改善胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂及肝組織脂肪樣變；在血管方面，可通過上調(diào)腎血管性高血壓大鼠

7、血管eNOS表達(dá)，增加NO產(chǎn)生，增強(qiáng)大鼠動脈內(nèi)皮依賴性舒張，發(fā)揮抗高血壓作用。此外，CIHH還具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗氧化等有益作用。據(jù)此，我們提出假設(shè)：CIHH可明顯改善代謝綜合征肥胖大鼠血管內(nèi)皮功能障礙及血管舒縮功能紊亂，此作用可能通過增強(qiáng)自噬功能，降低ERS，增加NO產(chǎn)生所實現(xiàn)。
　　本研究擬利用代謝綜合征肥胖大鼠，應(yīng)用形態(tài)學(xué)、生理學(xué)以及分子生物學(xué)等方法，從整體、組織和細(xì)胞不同水平明確CIHH對代謝綜合征肥胖大鼠腸系膜阻力血管

8、內(nèi)皮和血管舒縮的影響，并探討其機(jī)制。
　　本研究分為三部分：
　　(1)通過形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和微血管張力測定等方法確定CIHH對代謝綜合征肥胖大鼠腸系膜動脈血管內(nèi)皮和血管舒縮功能的保護(hù)作用。
　　(2)通過離體血管培養(yǎng)、微血管張力測定和Western blot等方法探討抗氧化應(yīng)激和ERS在CIHH血管內(nèi)皮保護(hù)中的作用。
　　(3)通過離體器官培養(yǎng)、微血管張力測定和Western blot等方法探討自噬在CIHH血

9、管內(nèi)皮保護(hù)中的作用。
　　第一部分：慢性間歇性低壓低氧對代謝綜合征大鼠血管內(nèi)皮和舒縮功能的保護(hù)作用
　　目的：
　　明確CIHH對代謝綜合征大鼠血管內(nèi)皮和血管舒縮功能障礙的保護(hù)作用。
　　方法：
　　成年雄性Sprague-Dawlay大鼠隨機(jī)分為四組：對照組(CON)、慢性間歇性低壓低氧處理組(CIHH)、代謝綜合征模型組(MS)、代謝綜合征模型+慢性間歇性低壓低氧處理組(MS+CIHH)。CON大鼠和C

10、IHH大鼠給予常規(guī)飼料和普通飲用水喂養(yǎng)。MS大鼠和MS+CIHH大鼠給予高脂飼料加10％果糖水喂養(yǎng)誘導(dǎo)MS。16周后，CIHH和MS+CIHH大鼠接受相當(dāng)于海拔5000m高度、28天、每天6小時的低壓低氧處理，其余時間置于常氧環(huán)境。CON和MS大鼠始終置于常氧環(huán)境。CIHH處理期間，每周固定時間測定大鼠體重和動脈收縮壓變化。28天CIHH處理完畢后，測量大鼠身長、體重和體脂，計算Lee's指數(shù)和脂肪系數(shù)；掃描電鏡下觀察腸系膜血管周圍脂肪

11、細(xì)胞的大??；取靜脈血測定血液生化指標(biāo)(空腹葡萄糖、胰島素、C肽、脂類)、炎癥因子(白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α)、粘附分子(細(xì)胞間粘附分子-1和血管細(xì)胞粘附分子-1)、NO和內(nèi)皮素-1(ET-1)；利用微血管環(huán)張力測定法分別描記苯腎上腺素(PE)和去甲腎上腺素(NE)誘導(dǎo)的動脈環(huán)收縮反應(yīng)，乙酰膽堿(ACh)誘導(dǎo)的動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張(EDR)和硝普鈉(SNP)誘導(dǎo)的動脈環(huán)非內(nèi)皮依賴性舒張。
　　結(jié)果：

12、　　1.與CON大鼠相比較，MS大鼠動脈收縮壓和體重顯著增加(P<0.05)；CIHH處理對正常大鼠基礎(chǔ)動脈收縮壓和體重?zé)o影響(P>0.05)，但可顯著對抗MS大鼠動脈收縮壓的升高和體重的增加(P<0.05)。
　　2.與CON大鼠相比較，MS大鼠Lee's指數(shù)、脂肪系數(shù)和腸系膜血管周圍脂肪細(xì)胞直徑明顯增加；CIHH處理對正常大鼠Lee's指數(shù)、脂肪系數(shù)和腸系膜血管周圍脂肪細(xì)胞的大小無影響(P>0.05)，但可顯著對抗MS大鼠的肥

13、胖表征和脂肪細(xì)胞增生(P<0.05-0.01)。
　　3.與CON大鼠相比較，MS大鼠表現(xiàn)明顯的糖、脂代謝紊亂和胰島素抵抗(P<0.05)；CIHH處理對正常大鼠代謝無明顯影響(P>0.05)，但可顯著對抗MS大鼠的糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗(P<0.05-0.01)。
　　4.與CON大鼠相比較，MS大鼠表現(xiàn)炎癥因子、粘附分子升高和NO與ET-1失衡(P<0.05-0.01)；CIHH處理對正常大鼠炎癥因子、粘附分子和NO與

14、ET-1平衡無影響(P>0.05)，但可顯著對抗MS大鼠的炎癥因子、粘附分子升高和NO與ET-1失衡(P<0.05-0.01)。
　　5.與CON大鼠相比較，MS大鼠腸系膜動脈環(huán)對PE和NE反應(yīng)性明顯升高，收縮增強(qiáng)(P<0.01)；CIHH處理降低大鼠腸系膜動脈環(huán)對PE和NE收縮反應(yīng)性，減弱收縮(P<0.05-0.01)，并對抗MS大鼠動脈環(huán)收縮的增強(qiáng)(P<0.01)。
　　6.與CON大鼠相比較，MS大鼠腸系膜動脈EDR顯

15、著降低(P<0.01)；CIHH處理明顯增強(qiáng)腸系膜動脈EDR(P<0.01)，并對抗MS大鼠腸系膜動脈EDR的降低(P<0.01)。
　　7.與CON大鼠相比較，MS大鼠腸系膜動脈非內(nèi)皮依賴性舒張明顯降低(P<0.05)；CIHH處理可增加大鼠腸系膜動脈非內(nèi)皮依賴性舒張(P<0.01)，并對抗MS大鼠腸系膜動脈非內(nèi)皮依賴性舒張的降低(P<0.01)。
　　小結(jié)：
　　本部分研究結(jié)果表明，高脂高果糖飲食誘導(dǎo)的肥胖MS大鼠

16、存在明顯的糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗，動脈收縮壓升高，內(nèi)皮功能損傷以及血管舒縮功能紊亂；CIHH處理可能通過降低胰島素抵抗，減輕炎癥，增加NO產(chǎn)生，從而減輕MS大鼠糖脂代謝紊亂、增強(qiáng)血管內(nèi)皮功能和改善血管舒縮功能異常。
　　第二部分：慢性間歇性低壓低氧通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善代謝綜合征大鼠腸系膜動脈內(nèi)皮依賴性舒張
　　目的：
　　探討氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在CIHH對代謝綜合征大鼠腸系膜動脈內(nèi)皮依賴性舒張改善中的作用及其機(jī)制

17、。
　　方法：
　　成年雄性Sprague-Dawlay大鼠隨機(jī)分為四組：對照組(CON)、慢性間歇性低壓低氧處理組(CIHH)、代謝綜合征模型組(MS)、代謝綜合征模型+慢性間歇性低壓低氧處理組(MS+CIHH)。CON大鼠和CIHH大鼠給予常規(guī)飼料和普通飲用水喂養(yǎng)。MS大鼠和MS+CIHH大鼠給予高脂飼料加10％果糖水喂養(yǎng)誘導(dǎo)MS。16周后，CIHH和MS+CIHH大鼠接受相當(dāng)于海拔5000m高度、28天、每天6小時的低

18、壓低氧處理，其余時間置于常氧環(huán)境。CON和MS大鼠始終置于常氧環(huán)境。應(yīng)用微血管環(huán)張力測定法，觀測 NO合酶抑制劑 L-NAME、超氧陰離子清除劑4-Hydroxy-TEMPO和ERS抑制劑4-苯基丁酸(PBA)對EDR的影響；應(yīng)用Western blot方法觀測CIHH對腸系膜動脈eNOS磷酸化蛋白表達(dá)，以及ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；利用離體器官培養(yǎng)、微血管環(huán)張力測定法和Western blot方法，觀察ERS誘導(dǎo)劑衣霉素(Tu)和抑制

19、劑PBA對CIHH處理MS大鼠腸系膜動脈EDR、eNOS磷酸化水平和ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.與CON大鼠相比較，L-NAME對MS大鼠動脈環(huán)EDR抑制作用顯著降低(P<0.01)，對CIHH大鼠動脈環(huán)EDR抑制作用顯著增強(qiáng)(P<0.01)，可有效對抗MS大鼠對L-NAME抑制效應(yīng)的降低(P<0.01)。
　　2.與CON大鼠相比，4-Hydroxy-TEMPO對MS大鼠動脈環(huán)EDR的增強(qiáng)作用顯著

20、增加(P<0.01)，對CIHH大鼠動脈環(huán)EDR的增強(qiáng)作用明顯降低(P<0.01)，可有效對抗MS大鼠對4-Hydroxy-TEMPO增強(qiáng)作用的增加(P<0.05)。
　　3.與CON大鼠相比，PBA對MS大鼠動脈環(huán)EDR的增強(qiáng)效應(yīng)顯著增加(P<0.01)。對CIHH大鼠動脈環(huán)EDR增強(qiáng)效應(yīng)無顯著性差異(P>0.05)。與MS大鼠相比較， PBA對MS+CIHH大鼠動脈環(huán)EDR增強(qiáng)效應(yīng)顯著降低(P<0.01)。
　　4.與C

21、ON大鼠相比較，MS大鼠腸系膜動脈eNOS(Ser1177)磷酸化明顯降低(P<0.01)， CIHH大鼠腸系膜動脈eNOS(Ser1177)磷酸化無顯著差異(P>0.05)，但可有效對抗MS大鼠腸系膜動脈eNOS(Ser1177)磷酸化的降低(P<0.01)。
　　5.與CON大鼠相比較， MS大鼠腸系膜動脈ERS相關(guān)蛋白GRP78和CHOP表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，CIHH大鼠腸系膜動脈GRP78和CHOP表達(dá)無顯著差異(

22、P>0.05)，但可有效對抗MS大鼠GRP78和CHOP表達(dá)的上調(diào)(P<0.05-0.01)。
　　6.ERS誘導(dǎo)劑Tu可顯著抑制MS+CIHH大鼠動脈環(huán)ACh誘發(fā)的EDR(P<0.01)，而ERS抑制劑PBA可顯著增加MS+CIHH動脈環(huán)ACh誘發(fā)的EDR(P<0.01)。
　　7.ERS誘導(dǎo)劑Tu顯著增加MS+CIHH大鼠動脈環(huán)GRP78和CHOP蛋白表達(dá)(P<0.05-0.01)，下調(diào)eNOS(Ser1177)磷酸化(

23、P<0.01)；而ERS抑制劑PBA顯著降低MS+CIHH大鼠動脈環(huán)GRP78和CHOP蛋白表達(dá)(P<0.05-0.01)，上調(diào)eNOS(Ser1177)磷酸化(P<0.01)。
　　小結(jié)：
　　本部分研究結(jié)果表明，高脂高果糖飲食誘導(dǎo)的肥胖MS大鼠腸系膜動脈存在明顯的氧化應(yīng)激和ERS，通過降低eNOS磷酸化，導(dǎo)致NO生成減少、血管舒張功能障礙；CIHH可通過降低氧化應(yīng)激和ERS，增強(qiáng)eNOS磷酸化，增加NO產(chǎn)生，從而改善內(nèi)皮

24、功能障礙和增強(qiáng)血管舒張功能。
　　第三部分：慢性間歇性低壓低氧通過增強(qiáng)自噬改善代謝綜合征大鼠腸系膜動脈內(nèi)皮依賴性舒張
　　目的：
　　探討自噬在CIHH對代謝綜合征大鼠腸系膜動脈內(nèi)皮依賴性舒張改善中的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　成年雄性Sprague-Dawlay大鼠隨機(jī)分為四組：對照組(CON)、慢性間歇性低壓低氧處理組(CIHH)、代謝綜合征模型組(MS)和代謝綜合征模型+慢性間歇性低壓低氧處理組(

25、MS+CIHH)。CON和CIHH大鼠給予常規(guī)飼料和普通飲用水喂養(yǎng)。MS大鼠和MS+CIHH大鼠給予高脂飼料加10％果糖水喂養(yǎng)誘導(dǎo)MS。16周后，CIHH大鼠和MS+CIHH大鼠接受相當(dāng)于海拔5000m高度、28天、每天6小時的低壓低氧處理，其余時間置于常氧環(huán)境。CON大鼠和MS大鼠始終置于常氧環(huán)境。利用Western blot方法，觀察自噬相關(guān)蛋白、AMPK磷酸化和mTOR磷酸化；利用離體器官培養(yǎng)、微血管環(huán)張力測定法和Western

26、blot方法，分別觀察ERS誘導(dǎo)劑Tu和抑制劑PBA、自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(RAPA)和抑制劑3甲基腺嘌呤(3MA)、AMPKα抑制劑復(fù)合物C(Com C)和mTOR抑制劑RAPA對大鼠腸系膜動脈EDR及相應(yīng)蛋白表達(dá)的影響；利用離體器官培養(yǎng)、透射電子顯微鏡和Western blot方法，檢測自噬降解阻斷劑氯喹(CQ，即溶酶體抑制劑)對自噬流的影響。
　　結(jié)果：
　　1.ERS誘導(dǎo)劑Tu顯著增加MS+CIHH動脈環(huán)自噬相關(guān)蛋白B

27、eclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)(P<0.01)，而ERS抑制劑PBA顯著降低Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)(P<0.05-0.01)。
　　2.自噬誘導(dǎo)劑RAPA顯著增加 MS+CIHH動脈環(huán) ACh誘導(dǎo)的EDR(P<0.01)，而自噬抑制劑3MA顯著抑制MS+CIHH動脈環(huán)ACh誘導(dǎo)的EDR(P<0.01)。
　　3.自噬誘導(dǎo)劑RAPA顯著增加 MS+CIHH動脈環(huán)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ/

28、Ⅰ的表達(dá)(P<0.01)，降低ERS相關(guān)蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)(P<0.01)，上調(diào)eNOS(Ser1177)磷酸化(P<0.05)；而自噬抑制劑3MA顯著降低MS+CIHH動脈環(huán)Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)(P<0.05)，增加GRP78和CHOP蛋白表達(dá)(P<0.05-0.01)，下調(diào)eNOS(Ser1177)磷酸化(P<0.01)。
　　4.與CON大鼠相比較，MS大鼠腸系膜動脈自噬相關(guān)蛋白Beclin-

29、1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05-0.01)。與MS大鼠相比較， MS+CIHH大鼠腸系膜動脈Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。
　　5.自噬降解阻斷劑CQ可增加各組大鼠腸系膜動脈自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62的表達(dá)，其中CIHH大鼠蛋白升高最大(P<0.05-0.01)，MS大鼠蛋白升高最小(P<0.05-0.01)。
　　6.與CON大鼠相比較，MS大鼠腸系

30、膜動脈AMPK(Thr172)磷酸化明顯下調(diào)，mTOR(Ser2448)磷酸化明顯上調(diào)(P<0.01)。與MS大鼠相比較，MS+CIHH大鼠腸系膜動脈的AMPK(Thr172)磷酸化明顯上調(diào)，mTOR(Ser2448)磷酸化明顯下調(diào)(P<0.01)。
　　7.AMPKα抑制劑Com C可顯著抑制MS+CIHH大鼠腸系膜動脈的EDR(P<0.01)，而mTOR抑制劑RAPA可顯著增加MS+CIHH大鼠腸系膜動脈EDR(P<0.01)

31、。
　　8.AMPKα抑制劑Com C可顯著降低MS+CIHH大鼠腸系膜動脈的AMPK(Thr172)磷酸化(P<0.01)，增加mTOR(Ser2448)磷酸化(P<0.01)，降低Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)(P<0.05-0.01)，升高GRP78和CHOP蛋白表達(dá)(P<0.01)，下調(diào)eNOS(Ser1177)磷酸化(P<0.01)；而mTOR抑制劑RAPA增加MS+CIHH大鼠腸系膜動脈的AMPK(Thr17

32、2)磷酸化(P<0.01)，降低mTOR(Ser2448)磷酸化(P<0.01)，增加Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)(P<0.01)，降低GRP78和CHOP蛋白表達(dá)(P<0.05-0.01)，上調(diào)eNOS(Ser1177)磷酸化(P<0.01)。
　　小結(jié)：
　　本部分研究結(jié)果表明，高脂高果糖飲食誘導(dǎo)的肥胖MS大鼠腸系膜動脈AMPK-mTOR信號通路活性降低、自噬流降解途徑障礙、ERS介導(dǎo)的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)增強(qiáng)、

33、eNOS磷酸化下調(diào)、內(nèi)皮功能受損和EDR反應(yīng)降低；CIHH通過激活MS大鼠腸系膜動脈AMPK-mTOR信號通路，改善自噬流的功能，降低ERS，促進(jìn)eNOS磷酸化，增加NO產(chǎn)生，從而保護(hù)血管內(nèi)皮和增強(qiáng)EDR反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　高脂高果糖飲食誘導(dǎo)的肥胖代謝綜合征大鼠呈現(xiàn)明顯的糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、炎癥和氧化應(yīng)激，腸系膜動脈ERS和自噬功能障礙、血管內(nèi)皮功能損傷和舒縮功能紊亂。
　　CIHH處理對代謝綜合征大鼠腸系膜