活性氧在慢性間歇性低壓低氧適應(yīng)性心臟保護形成中的作用和機制.pdf

1、近年來，慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia，CIHH)對心臟的保護作用及其機制的研究越來越引起人們的關(guān)注，已成為臨床醫(yī)學(xué)、航天醫(yī)學(xué)和高原醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點之一。CIHH的心臟保護作用主要包括抗缺血性損傷，抗心律失常和改善心肌退行性變?nèi)齻€方面。其作用機制可能與促進心肌毛細(xì)血管增生、增加冠脈血流量、激活A(yù)TP敏感性鉀通道、抑制線粒體通透轉(zhuǎn)換孔以及抑制心肌細(xì)胞膜腎上腺素能受體活性

2、等因素有關(guān)。然而，這些研究均是針對CIHH處理后結(jié)果，即CIHH處理的最終效應(yīng)所進行的。然而，有關(guān)CIHH適應(yīng)性心臟保護作用的形成過程及機制尚未見報道。目前一致的觀點認(rèn)為，活性氧(reactiveoxygen species，ROS)具有保護性或損傷性雙重作用，取決于ROS的數(shù)量。大量證據(jù)表明，ROS在低濃度時表現(xiàn)心臟保護作用，而高濃度時可導(dǎo)致心肌損傷作用。在培養(yǎng)的細(xì)胞或者整體動物水平，間歇性低氧均可刺激ROS產(chǎn)生，ROS可以通過介導(dǎo)信

3、號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制而參與細(xì)胞和機體對間歇性低氧的適應(yīng)性反應(yīng)。已有研究證實核轉(zhuǎn)錄因子2-硫氧還蛋白1-低氧誘導(dǎo)因子1(Nrf2-Trx1-HIF-1α)信號途徑介導(dǎo)由ROS誘導(dǎo)的間歇性低氧反應(yīng)。但迄今為止，尚不清楚ROS是否參與CIHH適應(yīng)性心臟保護的形成。
　　本研究旨在利用功能學(xué)、藥物學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法，在清醒動物整體、離體心臟和細(xì)胞分子水平動態(tài)觀測CIHH適應(yīng)性心臟保護的產(chǎn)生過程，并探討ROS在其中的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。研

4、究分為以下三個部分：(1)利用生理信號遙測系統(tǒng)在清醒大鼠，動態(tài)觀測CIHH適應(yīng)形成過程中心血管活動的變化，并明確ROS在其中的作用。(2)證實Nrf2-Trx1-HIF1α分子途徑及其主要的下游信號分子參與CIHH適應(yīng)性心臟保護的形成，以及ROS在其中的作用。(3)明確CIHH對勁動脈體化學(xué)感受器敏感性的影響及ROS在其中的作用。
　?、?、活性氧參與清醒大鼠慢性間歇性低壓低氧適應(yīng)過程中心血管活動的動態(tài)變化
　　目的：CIHH

5、具有心臟保護作用。大量證據(jù)表明低氧刺激產(chǎn)生的ROS可作為第二信使激發(fā)機體產(chǎn)生各種適應(yīng)性反應(yīng)。本研究旨在探討CIHH適應(yīng)過程中心血管活動的動態(tài)變化，以及ROS所起的作用。
　　方法：雄性SD大鼠隨機分為四組：對照組(Control)、間歇性低壓低氧處理組(CIHH)、抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸處理組(Control+NAC)和應(yīng)用N-乙酰半胱氨酸同時間歇性低壓低氧處理組(CIHH+NAC)。CIHH組大鼠置于低壓氧艙，給予42天模擬海

6、拔5000米的低壓低氧處理，每天6小時，其余時間處于常氧環(huán)境。Control+NAC組大鼠每天同一時間皮下注射NAC(80 mg/kg)。CIHH+NAC組大鼠每天上倉前皮下注射NAC。Control組動物除不接受CIHH及NAC處理外，其余處理與CIHH大鼠相同。利用清醒動物生理信號遙測系統(tǒng)監(jiān)測和分析大鼠在相應(yīng)處理過程中平均動脈壓(MAP)和心率(HR)的變化。應(yīng)用ELISA方法測定左心室心肌組織中總超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫

7、酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(GPX)、丙二醛(MDA)、類脂褐素(LFP)、蛋白羰基(PCL)和谷胱甘肽/二硫化谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)以監(jiān)測心肌的氧化應(yīng)激水平。
　　結(jié)果：
　　(1)CIHH大鼠心肌組織GSH-PX，MDA和LFP增加，GSH/GSSG降低(P<0.05)，說明CIHH可提高心肌氧化應(yīng)激水平和ROS的產(chǎn)生。
　　(2)CIHH不影響常氧狀態(tài)下各組動物的MAP。但可以取消HR隨年齡的降低

8、(P<0.05)，NAC處理可部分阻斷CIHH(P<0.05)這一作用。
　　(3)在低壓低氧倉內(nèi)，CIHH大鼠的MAP和HR出現(xiàn)適應(yīng)性變化。早期(上倉1小時內(nèi))MAP和HR迅速升高達(dá)到峰值(P<0.05)，而后逐漸降至最低。后期(上倉2至6小時內(nèi))，MAP和HR相對穩(wěn)定，呈平臺水平。隨CIHH處理時間的延長，MAP和峰值和平臺值逐漸升高，達(dá)峰值的時間縮短(P<0.05)。HR的峰值逐漸降低，達(dá)峰值時間延長，而其平臺值逐漸升高(P

9、<0.05)。NAC處理可部分取消MAP和HR的適應(yīng)性變化。
　　(4)給予急性常壓低氧刺激，CIHH大鼠的MAP和HR升高幅度明顯低于Control和Control+NAC組動物(P<0.05)。CIHH的這種抗低氧損傷作用至少可持續(xù)兩周。NAC處理可部分阻斷CIHH的此種作用(P<0.05)。
　　結(jié)論：本研究首次在清醒大鼠證實，CIHH過程產(chǎn)生的適量ROS參與CIHH過程中MAP和HR的適應(yīng)性變化，并參與形成對抗急性低

10、氧損傷的適應(yīng)性保護機制。這種ROS依賴的適應(yīng)性保護作用產(chǎn)生至少需要28天的CIHH所激發(fā)；而且在CIHH處理結(jié)束后，這種保護作用可持續(xù)至少兩周。
　?、?、活性氧激活的Nrf2-Trx1-HIF1信號途徑參與大鼠慢性間歇性低壓低氧適應(yīng)性心臟保護的形成
　　目的：探討CIHH適應(yīng)形成過程中Nrf2-Trx1-HIF1信號途徑及其主要下游分子的激活，以及ROS在其中的作用。
　　方法：實驗分組和CIHH處理同本研究第一部分。

11、利用Western印跡和免疫組織化學(xué)的方法觀測左心室心肌組織中Nrf2，Trx1，HIF1α，iNOS，VEGF and EPO的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　(1)CIHH過程中Nrf2-Trx1-HIF1信號途徑被激活。CIHH處理28天后，Nrf2，Trx1，HIF1α表達(dá)明顯增強(P<0.05)。CIHH大鼠左心室心肌組織中，Nrf2的核轉(zhuǎn)位及Nrf2陽性細(xì)胞核數(shù)均明顯增加(P<0.05)。NAC處理可部分阻斷這些效應(yīng)(P

12、<0.05)。
　　(2)ROS可誘導(dǎo)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，即Nrf2的激活。CIHH處理1天后，心肌細(xì)胞核中Nrf2的表達(dá)明顯升高，陽性細(xì)胞核數(shù)增加(P<0.05)。應(yīng)用NAC抑制了Nrf2的表達(dá)(P<0.05)，Nrf2的激活推遲至CIHH處理2天以后。
　　(3)ROS介導(dǎo)CIHH過程中Nrf2-Trx1-HIF1信號途徑的激活。在心肌的全細(xì)胞提取物中，Nrf2在CIHH處理的2天后被激活(P<0.05)，Trx1和HIF

13、1在CIHH處理3天后被激活(P<0.05)。應(yīng)用NAC抑制這些信號分子的表達(dá)，并將Nrf2、Trx1和HIF1信號分子激活時間分別推遲至CIHH處理后3天或5天。
　　(4)接受CIHH處理7或14天后，Nrf2-Trx1-HIF1信號途徑的下游信號分子iNOS，VEGF和EPO的表達(dá)明顯提高(P<0.05)。NAC可部分取消CIHH的上述作用(P<0.05)。
　　結(jié)論：Nrf2-Trx1-HIF1信號途徑及其主要下游分

14、子iNOS，VEGF和EPO在CIHH適應(yīng)形成過程中被激活。iNOS，VEGF和EPO參與ROS依賴的CIHH適應(yīng)性心臟保護機制。
　?、?、慢性間歇性低壓低氧通過適應(yīng)過程中產(chǎn)生的ROS易化頸動脈體化學(xué)感受器活動
　　目的：探討CIHH對頸動脈體化學(xué)感覺器敏感性及呼吸頻率(respiration frequency，RF)的影響，明確ROS在其中的作用。
　　方法：實驗分組和CIHH處理同本研究第一部分。利用生理信號遙測

15、系統(tǒng)記錄和分析不同處理過程中清醒動物的呼吸頻率變化。采用全神經(jīng)雙根鉑絲電極記錄法記錄頸動脈體竇神經(jīng)放電活動(carotid sinus nerveactivity，CSNA)。
　　結(jié)果：
　　(1)Control組大鼠的RF無明顯年齡依賴性變化。各組大鼠的基礎(chǔ)RF無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　(2)在低壓低氧倉內(nèi)，CIHH大鼠的RF出現(xiàn)適應(yīng)性變化。早期(上倉1小時內(nèi))RF迅速升高達(dá)到峰值，而后逐漸降至最低(P<0.05)。后期

16、(上倉2至6小時內(nèi))，RF相對穩(wěn)定，呈平臺水平。隨CIHH處理時間的延長，RF的峰值逐漸降低，達(dá)峰值時間延長(P<0.05)，而其平臺值逐漸升高(P<0.05)。NAC處理可部分取消RF的適應(yīng)性變化(P<0.05)。
　　(3)給予急性常壓低氧刺激，CIHH大鼠的RF升高幅度明顯低于Control和Control+NAC組動物(P<0.05)。CIHH的這種抗低氧損傷作用至少可持續(xù)兩周(P<0.05)。NAC處理可部分阻斷CIHH