慢性間歇性低壓低氧抗大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎作用及其免疫學(xué)機(jī)制.pdf

1、大量研究表明，慢性間歇性低壓低氧(Chronic intermittent hypobaric hypoxia，CIHH)對(duì)機(jī)體多種組織、器官均有益處，例如增強(qiáng)機(jī)體對(duì)缺血、缺氧耐受性，對(duì)抗缺血/再灌注所致心臟功能損傷及心律失常，保護(hù)神經(jīng)、肝臟等器官組織，以及降壓作用。CIHH作為增強(qiáng)機(jī)體、組織對(duì)缺氧耐受性的手段在體育運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中也被廣泛應(yīng)用。有限的研究表明CIHH對(duì)機(jī)體的免疫機(jī)能具有影響作用。我們以往研究顯示，CIHH處理具有免疫調(diào)節(jié)作用

2、，可對(duì)抗急性低氧所致的免疫功能失調(diào)。也有文獻(xiàn)報(bào)道CIHH對(duì)慢性阻塞性支氣管炎及支氣管哮喘有一定輔助治療作用。因此，有理由推測(cè)CIHH對(duì)免疫性疾病，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)具有某種預(yù)防或治療作用。
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種病因尚未完全明確的慢性全身性自身免疫炎性疾病，以進(jìn)行性、對(duì)稱性、多關(guān)節(jié)滑膜炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，同時(shí)可伴發(fā)心血管、神經(jīng)系統(tǒng)及代謝系統(tǒng)疾病。有關(guān)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究和

3、各種治療手段的開發(fā)是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen induced arthritis，CIA)大鼠模型是目前應(yīng)用較廣泛的且較成熟的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，該模型關(guān)節(jié)組織病理學(xué)與血中的變化特點(diǎn)與人類RA相似，為一種典型的免疫性炎癥模型，常用于關(guān)節(jié)炎的研究。本研究旨在通過(guò)CIA動(dòng)物模型，給以不同程度的CIHH處理，利用流式檢測(cè)、免疫組化、ELISA、分子生物學(xué)等方法，從動(dòng)物整體、離體組織及細(xì)胞不同水平，系統(tǒng)、動(dòng)態(tài)

4、地觀察CIHH預(yù)處理和后處理對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的影響，并深入探討其免疫學(xué)機(jī)制。
　　 本研究分為四部分：(1)應(yīng)用ELISA、HE染色、免疫組化等方法觀察CIHH對(duì)大鼠CIA的影響，初步探討其抗炎作用機(jī)制；(2)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、免疫組織化學(xué)法觀察CIHH對(duì)CIA大鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響，探討CIHH抗CIA作用的細(xì)胞免疫機(jī)制。(3)應(yīng)用原位末端標(biāo)記法（Terminal dUTP nick end labeling，T

5、UNEL）、流式細(xì)胞術(shù)及免疫組化等方法觀察CIHH對(duì)CIA大鼠細(xì)胞凋亡率的影響，探討CIHH抗CIA作用的細(xì)胞凋亡機(jī)制。(4)應(yīng)用Westem blots方法觀察CIHH對(duì)CIA大鼠核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor1，HIF-1α)蛋白表達(dá)的影響，探討CIHH抗CIA作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 Ⅰ慢性間歇性低壓低氧抗大鼠膠原誘導(dǎo)

6、性關(guān)節(jié)炎作用
　　 目的：應(yīng)用ELISA、HE染色、免疫組化等方法研究CIHH對(duì)大鼠CIA的影響，并探討其抗炎作用機(jī)制。
　　 方法：雄性成年SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組：CIHH預(yù)處理組(Pre-T)、預(yù)處理對(duì)照組(Pre-C)、CIHH后處理組(Post-T)、后處理對(duì)照組(Post-C)及空白對(duì)照組(Con)。Pre-T和Post-T大鼠分別在CIA造模前和造模后給以28天模擬海拔3000m(PO2=108.8mm

7、Hg，O2:14％)、每天5小時(shí)的CIHH;Pre-C和Post-C只給予CIA造模；Con大鼠不給任何處理。測(cè)定大鼠雙后足爪厚度，以關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎程度；HE染色觀察踝關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)變化；免疫組化SP法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞因子TNF-α、IL-6表達(dá)；ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-6水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.Pre-T大鼠CIA發(fā)生率(20％)明顯低于Pre-C組大鼠(70％)，Post-T與

8、Post-C間CIA發(fā)生率無(wú)明顯變化。
　　 2.Pre-T和Post-T大鼠的足爪厚度和AI值低于Pre-C和Post-C組大鼠(P＜0.05)。
　　 3.Pre-C及Post-C關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞明顯增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)增加，形成血管翳，侵蝕軟骨及骨，Pre-T和Post-T大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理改變明顯減輕。
　　 4.與Pre-C及Post-C大鼠比較，Pre-T和Post-T大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織及血清TN

9、F-α、IL-6水平明顯降低（P＜0.05）。
　　 小結(jié)：CIHH處理具有抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用，可有效預(yù)防大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)組織滑膜炎癥，改善關(guān)節(jié)組織病理?yè)p傷，這種保護(hù)作用可能與CIHH抑制炎性細(xì)胞因子TNF-a、IL-6的產(chǎn)生有關(guān)。
　　 Ⅱ慢性間歇性低壓低氧抗大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎作用的T淋巴細(xì)胞免疫機(jī)制
　　 目的：觀察CIHH對(duì)CIA大鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響，并探討其抗CIA作用

10、的細(xì)胞免疫機(jī)制。
　　 方法：雄性成年SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組：CIHH預(yù)處理組(Pre-T)、預(yù)處理對(duì)照組(Pre-C)、CIHH后處理組(Post-T)、后處理對(duì)照組(Post-C)及空白對(duì)照組(Con)。Pre-T和Post-T大鼠分別在CIA造模前和造模后給以28天模擬海拔3000m（PO2=108.8mmHg，O2:14％）、每天5小時(shí)的CIHH;Pre-C和Post-C只給予CIA造模；Con大鼠不給任何處理。流

11、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血液CD4、CD8T淋巴細(xì)胞；ELISA法檢測(cè)血清IFN-γ、IL-4、IL-17水平；免疫組化法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜組織IFN-γ、IL-4～I(xiàn)L-17表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.與Pre-C、Post-C組動(dòng)物相比，Pre-T、Post-T組動(dòng)物外周血CD4明顯下降(P＜0.05)，CD8升高，CD4/CD8比值降低(P＜0.05)，與Control組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 2.Pre

12、-T組動(dòng)物血清中IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4比值及IL-17水平較Pre-C組動(dòng)物明顯下降（P＜0.05）；Post-T組動(dòng)物較Post-C組動(dòng)物血清中IFN-γ、IFN-γ/IL-4比值及IL-17水平明顯下降，IL-4明顯升高(P＜0.05)。
　　 3.Pre-T組動(dòng)物滑膜組織IFN-γ、IL-4、IL-17水平較Pre-C組動(dòng)物明顯減低(P＜0.05)；與Post-C組比較，Post-T組動(dòng)物滑膜組織IFN

13、-γ、IL-17水平明顯下降，IL-4明顯升高(P＜0.05)。
　　 小結(jié)：CIHH處理具有穩(wěn)定CIA大鼠CD4+T細(xì)胞的增殖、維持T淋巴細(xì)胞亞群CD4/CD8、Th1/Th2穩(wěn)態(tài)、減少炎性細(xì)胞因子IL-17表達(dá)的作用。細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)可能是CIHH抗膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。
　　 Ⅲ 慢性間歇性低壓低氧抗大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎作用的細(xì)胞凋亡機(jī)制
　　 目的：觀察CIHH對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞和脾臟淋巴細(xì)胞凋亡

14、率的影響，探討其抗CIA作用的細(xì)胞凋亡機(jī)制。
　　 方法：雄性成年SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組：CIHH預(yù)處理組(Pre-T)、預(yù)處理對(duì)照組(Pre-C)、CIHH后處理組(Post-T)、后處理對(duì)照組(Post-C)及空白對(duì)照組(Con)。Pre-T和Post-T大鼠分別在CIA造模前和造模后給以28天模擬海拔3000m(PO2=108.8mmHg，O2：14％)、每天5小時(shí)的CIHH;Pre-C和Post-C只給予CIA造模

15、；Con大鼠不給任何處理。應(yīng)用原位末端標(biāo)記法（Terminal dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的凋亡率；脾臟組織制備成細(xì)胞懸液用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+T淋巴細(xì)胞凋亡率；用免疫組化SP法檢測(cè)滑膜細(xì)胞及脾臟細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.與Pre-C及Post-C大鼠比較，Pre-T和Post-T大鼠滑膜細(xì)胞及脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡率明顯增加(P＜0

16、.05)。
　　 2.與Pre-C及Post-C大鼠比較，Pre-T和Post-T動(dòng)物滑膜組織細(xì)胞及脾臟淋巴細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減低(P＜0.05)，Bax蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。
　　 小結(jié)：CIHH預(yù)處理和后處理可能通過(guò)抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)促進(jìn)關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞和脾臟T淋巴細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮抗大鼠CIA作用。
　　 Ⅳ 慢性間歇性低壓低氧抗大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)

17、制
　　 目的：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)觀察CIHH對(duì)CIA大鼠核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor1，HIF-1α)蛋白表達(dá)的影響，探討CIHH抗CIA作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：雄性成年SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組：CIHH預(yù)處理組(Pre-T)、預(yù)處理對(duì)照組(Pre-C)、CIHH后處理組(Post-T)、后處理對(duì)照組

18、(Post-C)及空白對(duì)照組(Con)。Pre-T和Post-T大鼠分別在CIA造模前和造模后給以28天模擬海拔3000m(PO2=108.8mmHg，O2:14％)、每天5小時(shí)的CIHH;Pre-C和Post-C只給予CIA造模；Con大鼠不給任何處理。應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)滑膜組織VEGF、TGF-β蛋白表達(dá)；滑膜組織勻漿后應(yīng)用Westemblots方法檢測(cè)HIF-1α、NF-κB蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.

19、Pre-T組動(dòng)物滑膜組織細(xì)胞VEGF、TGF-β蛋白表達(dá)明顯低于Pre-C組動(dòng)物(P＜0.05)。Post-T組動(dòng)物滑膜組織細(xì)胞VEGF、TGF-β蛋白表達(dá)亦明顯低于Post-C組動(dòng)物(P＜0.05)。
　　 2.Pre-T組動(dòng)物滑膜組織HIF-1α、NF-κB蛋白表達(dá)明顯低于Pre-C組動(dòng)物(P＜0.05)，NF-κB高于Control組動(dòng)物(P＜0.05)，而HIF-1α表達(dá)與Control組動(dòng)物無(wú)明顯差異（P＞0.05）。