線粒體ATP敏感性鉀通道介導(dǎo)肢體缺血后處理對抗大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用.pdf

1、肢體缺血預(yù)處理，即對肢體進行一輪或者數(shù)輪短暫性的缺血與再灌注循環(huán)，在隨后的器官或組織的長時程缺血及再灌注損傷中具有保護作用。這個器官既可以是進行缺血預(yù)處理的肢體本身，也可以是其他器官和組織，如心臟、腦和腎等。后者，即通過對某一器官或組織進行缺血預(yù)處理，能產(chǎn)生對遠(yuǎn)處的器官或組織的保護作用，稱為遠(yuǎn)距預(yù)處理。目前已經(jīng)有研究證明，肢體、腸系膜動脈或者腎動脈的缺血預(yù)處理可對抗心臟或腦隨后的較長時程的缺血再灌注損傷。 肢體缺血后處理(lim

2、bischemiapost-conditioning，LIPC)與肢體缺血預(yù)處理的方法類似，但有一點不同，即在其他器官或組織遭受較長時間缺血以后的再灌注期間，即刻進行短暫的肢體缺血和再灌注循環(huán)。這種缺血后處理方法已經(jīng)在心臟上被證明是有效的。然而，關(guān)于肢體缺血后處理在腦缺血再灌注損傷上的研究尚未見報道。我們認(rèn)為，LIPC對于臨床上的急性缺血性腦中風(fēng)的搶救以及治療(包括溶栓療法)具有重要的現(xiàn)實意義，而且其操作方法簡單，對人體的損傷微小。

3、 激活線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrialATPsensitivepotassiumchannel,mitoKATP)能減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，但其下游機制尚未明確。本實驗通過建立大鼠的局灶性腦缺血再灌注模型，觀察LIPC的神經(jīng)保護作用，并研究mitoKATP是否參與了LIPC的神經(jīng)保護及其下游機制。 目的：1.觀察LIPC在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的保護作用，并研究mitoKATP是否參與其作用

4、機制； 2.研究mitoKATP在腦缺血再灌注損傷中的保護作用，并探討線粒體鈣和線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔在mitoKATP激活后發(fā)生的變化，以及它們對腦缺血再灌注損傷的影響。 方法：1.LIPC模型的建立：大鼠腦再灌注的同時，立即進行單側(cè)或雙側(cè)后肢缺血10min再灌注10min的三輪循環(huán)；2.放射免疫法測定血漿中強啡肽和腦啡肽的水平：在LIPC結(jié)束后的24h內(nèi)分別測定大鼠血漿強啡肽和腦啡肽水平；3.大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的

5、建立：將頭端圓鈍的尼龍線從頸內(nèi)動脈插入大腦中動脈以造成局灶性腦梗塞，90min后抽出栓線進行復(fù)灌；4.大鼠側(cè)腦室立體定位給藥；5.大鼠神經(jīng)系統(tǒng)癥狀評分；6.TTC染色法測定大腦梗死面積；7.大鼠腦線粒體的制備；8.線粒體蛋白定量；9.電鏡觀察線粒體顯微結(jié)構(gòu)；10.線粒體腫脹程度的測定：用可見光分光光度法，測定分離腦線粒體在520nm下吸光度的改變；11.線粒體內(nèi)鈣離子濃度的測定：采用M&D公司的M2型酶標(biāo)儀，在激發(fā)波長540nm，發(fā)射波

6、長590nm的條件下，以rhod-2acetoxymethylester作為熒光探針，測定線粒體內(nèi)游離鈣離子濃度。 結(jié)果：第一部分：LIPC對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用以及mitoKATP在該作用中的地位 1.單側(cè)LIPC能改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)系統(tǒng)功能評分(P＜0.05)，并減少大腦梗死面積(P＜0.01)；而雙側(cè)LIPC能顯著提高大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)系統(tǒng)功能評分，并顯著減少

7、大腦梗死面積(P＜0.01)，比單側(cè)LIPC的作用更為明顯(P＜0.05)。 2.雙側(cè)LIPC以后的5min，15min，30min，1h和2h這五個時點中，血漿中的強啡肽水平顯著增高(P＜0.01)，12h和24h這兩個時點則恢復(fù)至正常水平；而血漿腦啡肽水平的改變與雙側(cè)LIPC前比較無顯著差異(P＞0.05)。 3.κ-阿片受體拮抗劑nor-binaltorphimine(nor-BNI)預(yù)處理(1μmol/L)阻斷了

8、雙側(cè)LIPC所致的神經(jīng)系統(tǒng)功能評分增加和大腦梗死面積減少的作用(P＜0.01)。 4.mitoKATP的選擇性阻斷劑5-hydroxydecanoate(5-HD)預(yù)處理(10mg/kg)取消了雙側(cè)LIPC所致的神經(jīng)系統(tǒng)功能評分增加和大腦梗死面積減少的影響(P＜0.01)。 第二部分：mitoKATP在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用及其下游機制1.與單純腦缺血再灌注組相比，在復(fù)灌前15min側(cè)腦室注射1μmol/L線

9、粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的阻斷劑cyclosporinA明顯提高神經(jīng)系統(tǒng)癥狀評分，并減少大腦梗死面積(P＜0.01)，2mmol/L的線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的特異性開放劑atractyloside可取消cyclosporinA的作用(P＜0.01)。在大腦中動脈梗塞術(shù)前20min側(cè)腦室注射2mmol/L的mitoKATP的開放劑diazoxide可明顯減少大腦梗死面積，并提高神經(jīng)系統(tǒng)癥狀評分(P＜0.01)，2mmol/L的5-HD和atracty

10、loside可取消diazoxide的以上作用(P＜0.01)。單獨使用5-HD或atractyloside對神經(jīng)系統(tǒng)癥狀評分和大腦梗死面積均無明顯作用(P＞0.05)。 2.與空白對照組相比，200μmol/L的Ca2+能誘導(dǎo)腦線粒體的A520快速大幅下降(P＜0.01)。加Ca2+之前2min給予0.5μmol/L或者1μmol/L的cyclosporinA，均明顯減輕Ca2+誘發(fā)的A520下降(P＜0.01)。在給予0.5

11、μmol/L或者1μmol/L的cyclosporinA之后2min加100μmol/L的atractyloside，則取消了cyclosporinA的作用(P＜0.01)。加Ca2+之前2min給予30μmol/L的diazoxide，可明顯減輕Ca2+誘發(fā)的A520下降(P＜0.01)。在給予diazoxide之后隨即加100μmol/L的5-HD，則減輕了diazoxide的作用(P＜0.01)。在給予diazoxide之后2mi

12、n加100μmol/L的atractyloside，取消了diazoxide的作用(P＜0.01)。單獨使用5-HD或atractyloside對Ca2+誘導(dǎo)的腦線粒體A520下降無明顯作用(P＞0.05)。 3.與空白對照組相比，100μmol/L的diazoxide明顯降低了線粒體內(nèi)Ca2+熒光強度(P＜0.01)，100μmol/L5-HD和atractyloside可取消diazoxide的作用(P＜0.01)。相似的，

13、1μmol/L的cyclosporinA也明顯降低線粒體內(nèi)Ca2+熒光強度(P＜0.01)，atractyloside則取消了cyclosporinA的作用(P＜0.01)。 結(jié)論：1.LIPC在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中具有顯著的神經(jīng)保護作用，其作用機制可能與LIPC誘導(dǎo)內(nèi)源性κ-阿片激動劑釋放，并激活mitoKATP有關(guān)。 2.mitoKATP的激活可減輕線粒體內(nèi)鈣超載，從而抑制線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔發(fā)生滲透性轉(zhuǎn)換，產(chǎn)