無(wú)創(chuàng)性延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)抗大鼠腦缺血再灌注損傷的線(xiàn)粒體相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、【目的】
　　本研究利用大鼠腦缺血再灌注（I/R）模型和無(wú)創(chuàng)性延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)（NDLIP）模型，探索線(xiàn)粒體 ATP敏感性鉀通道（mitoKATP）和線(xiàn)粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）在NDLIP對(duì)抗大鼠腦I/R損傷中的作用，觀察NDLIP在腦I/R損傷后對(duì)缺血區(qū)皮層線(xiàn)粒體膜電位及氧化呼吸鏈酶復(fù)合體活性的影響，探討NDLIP對(duì)抗腦I/R損傷的線(xiàn)粒體相關(guān)機(jī)制。
　　【方法】
　　健康的雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成9組。（1

2、）Sham組：取頸正中切口，分離頸部肌肉組織，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，但不夾閉。（2）I/R組：建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型，實(shí)施缺血1h/再灌注24h。（3）NDLIP組：每天實(shí)施左后肢缺血5min/再灌注5min，循環(huán)3次，連續(xù)3天，第4天建立MCAO模型，腦缺血1h/再灌注24h。（4） DIA組：尾靜脈注射 mitoKATP開(kāi)放劑二氮嗪（Diazoxide，DIA）5mg/kg（溶解于0

3、.1M NaOH溶液，注射劑量為0.6ml），30 min后建立MCAO模型，腦缺血1h/再灌注24h。（5）NDLIP+5-HD組：左后肢實(shí)施3次5min缺血/5min再灌注，每天1次，連續(xù)3天，第4天尾靜脈注射 mitoKATP抑制劑5-羥基喹酸鹽（5-Hydroxydecanoate sodium，5-HD）10mg/kg（溶解于0.9％生理鹽水，注射劑量為0.6ml），30 min后建立MCAO模型，對(duì)腦實(shí)施1h缺血/24h再灌

4、注。（6）NaOH組：尾靜脈注射0.1M NaOH溶液0.6ml，30 min后建立MCAO模型，對(duì)腦實(shí)施1h缺血/24h再灌注。（7）NDLIP+Atr組：左后肢實(shí)施3次5min缺血/5min再灌注，每天1次，連續(xù)3天，第4天側(cè)腦室注射mPTP開(kāi)放劑蒼術(shù)苷（atractyloside，Atr）10ul（3mM，溶解于0.9%生理鹽水），30 min后建立MCAO模型，對(duì)腦實(shí)施1h缺血/24h再灌注。（8） CsA組：側(cè)腦室注射 mPT

5、P抑制劑環(huán)孢素 A（Cyclosporin A， CsA）10ul（3uM，溶解于0.9%生理鹽水），30 min后建立MCAO模型，對(duì)腦實(shí)施1h缺血/24h再灌注。（9）NS組：側(cè)腦室注射0.9%生理鹽水（normal saline， NS）10ul，30 min后建立MCAO模型，對(duì)腦實(shí)施1h缺血/24h再灌注。大鼠實(shí)施1h缺血/24h再灌注后進(jìn)行行為評(píng)分觀察神經(jīng)功能變化，TTC染色法測(cè)定腦梗死面積，Western Blot法檢測(cè)皮

6、層Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白含量，提取缺血區(qū)皮層腦組織線(xiàn)粒體，JC-1探針檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位，比色法測(cè)定線(xiàn)粒體氧化呼吸連酶復(fù)合體I、II和IV的活性。
　　【結(jié)果】
　　1、大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血1h再灌注24h后，與I/R組（2.2±0.7）相比， NDLIP組（1.0±0）、DIA組（1.0±0）和CsA組（1.0±0）大鼠的行為評(píng)分明顯降低（p<0.01）；與 NDLIP組比較，NDLIP+5-HD組（1.

7、8±0.7）、NaOH組（2.2±0.7）、NDLIP+Atr組（2.0±1.0）和NS組（2.3±0.7）大鼠的行為評(píng)分顯著升高（p<0.01）。
　　2、大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血1h再灌注24h后，Sham組未見(jiàn)梗死區(qū)域，與I/R組（17.94%）相比，NDLIP組（10.88%）、DIA組（10.35%）和CsA組（9.91%）大鼠的腦組織梗死面積明顯降低（p<0.01）；與NDLIP組比較，NDLIP+5-HD組（19.18

8、%）、NaOH組（18.52%）、NDLIP+Atr組（18.24%）和NS組（19.29%）大鼠的腦組織梗死范圍顯著升高（p<0.01）。
　　3、大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血1h再灌注24h后，與Sham組相比，受到腦I/R損傷的大鼠缺血區(qū)皮層腦組織的Bax、Caspase3表達(dá)增多，Bcl-2表達(dá)降低，具有非常顯著性差異（p<0.01）；與I/R組比較，NDLIP組、DIA組和CsA組的Bax表達(dá)顯著下降（p<0.01），Casp

9、ase3表達(dá)明顯降低（p<0.01），而B(niǎo)cl-2表達(dá)則相對(duì)增高（p<0.01）；與 NDLIP組比較，NDLIP+5-HD組、NaOH組、NDLIP+Atr組和NS組的Bax表達(dá)顯著增高（p<0.01），Caspase3表達(dá)明顯增加（p<0.01），而B(niǎo)cl-2表達(dá)則相對(duì)降低（p<0.01）。
　　4、大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血1h再灌注24h后，與Sham組（171.97±5.20）相比，受到腦I/R損傷的大鼠線(xiàn)粒體膜電位明顯降低

10、（p<0.01），與I/R組（83.28±3.65）相比，NDLIP組（116.18±3.45）、DIA組（112.50±5.02）和CsA組（110.48±5.31）大鼠的線(xiàn)粒體膜電位明顯升高（p<0.01），與 NDLIP組比較， NDLIP+5-HD組（86.55±2.70）、NaOH組（81.58±2.60）、NDLIP+Atr組（80.41±9.28）和NS組（85.17±3.54）大鼠的線(xiàn)粒體膜電位顯著降低（p<0.01）。

11、
　　5、大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血1h再灌注24h后，與Sham組相比，受到腦I/R損傷的大鼠缺血區(qū)皮層腦組織的線(xiàn)粒體呼吸鏈酶復(fù)合體I、復(fù)合體II和復(fù)合體IV活性降低（p<0.01）；與I/R組比較，NDLIP組、DIA組和CsA組的復(fù)合體I、復(fù)合體II和復(fù)合體IV活性升高（p<0.01）；與NDLIP組比較，5-HD組、NaOH組、Atr組和NS組的復(fù)合體I、復(fù)合體II和復(fù)合體IV活性降低（p<0.01）。
　　【結(jié)論】

12、r>　　1、NDLIP能夠促進(jìn)mitoKATP通道的開(kāi)放，抑制mPTP開(kāi)放，減小腦I/R損傷后腦梗死面積，改善神經(jīng)功能障礙，起到腦保護(hù)作用。
　　2、I/R損傷后，損傷半球腦組織中的Bcl-2表達(dá)受到抑制， Bax和凋亡蛋白酶caspases3含量升高，Bcl-2/Bax降低，表明I/R損傷后，由Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)的線(xiàn)粒體相關(guān)的凋亡通路被激活，而NDLIP能夠明顯抑制這一凋亡信號(hào)通路，其機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)mitoKATP通道的