缺血預(yù)適應(yīng)相關(guān)基因WDR26對(duì)腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、腦缺血.再灌注損傷是臨床上常見的病理現(xiàn)象，如腦血管病的手術(shù)治療、腦血管意外后的血管自通或者溶栓治療、腦外傷的治療、心肺腦復(fù)蘇治療等，都可能發(fā)生腦缺血-再灌注損傷。尋找有效防治腦缺血-再灌注損傷的方法是當(dāng)代神經(jīng)科學(xué)的重要課題之一。腦缺血預(yù)適應(yīng)是到目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)有力的神經(jīng)內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象。揭示腦缺血預(yù)適應(yīng)的發(fā)生機(jī)制并予以利用，對(duì)腦缺血-再灌注損傷的防治具有重要意義，也是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。 WDR26基因是最近從大鼠心肌組織

2、中首次克隆的一個(gè)在缺血預(yù)適應(yīng)中表達(dá)上調(diào)的新基因，定位于染色體1q42.12，含14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子，ORF為1，545bp，編碼514個(gè)氨基酸，Northern雜交結(jié)果顯示其有四個(gè)剪切型。采用多組織膜研究發(fā)現(xiàn)，WDR26基因在腦組織中高表達(dá)。它是一個(gè)典型的WD-重復(fù)蛋白。WD-重復(fù)蛋白家族成員的序列在真核生物不同物種間均高度保守，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白運(yùn)輸、染色體修飾、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等多個(gè)生命過程中具有重要作用。但WDR26的生

3、物學(xué)功能目前尚不清楚。 為了深入探討WDR26在腦缺血預(yù)適應(yīng)及腦缺血-再灌注損傷中的生物學(xué)功能，本研究首先通過改良四血管阻斷法制備大鼠腦缺血預(yù)適應(yīng)及缺血.再灌注損傷模型，使全腦缺血3min，分別再灌注3h、6h、12h、24h，然后再行全腦缺血30min，再灌注24h，深麻醉下快速斷頭取腦，進(jìn)行腦水含量測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血3min再灌注24h后再行缺血30min再灌注24h，腦水含量較假手術(shù)對(duì)照組明顯減少，而其它實(shí)驗(yàn)組的腦水含量

4、與假手術(shù)組無明顯差異；說明缺血3min在灌注24h對(duì)其后的腦缺血-再灌注損傷導(dǎo)致的腦水腫具有明顯保護(hù)作用。采用real-timePCR檢測腦缺血3min再灌注后WDR26基因在腦組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血3min再灌注后WDR26基因在腦組織中的表達(dá)較假手術(shù)對(duì)照組明顯增高，再灌注6小時(shí)達(dá)到高峰。上述結(jié)果提示W(wǎng)DR26的表達(dá)增高可能是腦缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)機(jī)制的一部分。 氧化應(yīng)激是腦缺血-再灌注損傷的主要損傷機(jī)制之一。為了解WDR

5、26對(duì)氧化應(yīng)激所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用，本研究采用H2O2刺激制備氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，檢測WDR26基因在氧化應(yīng)激所致SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞損傷過程中的表達(dá)情況；將該基因的最大開放閱讀框架克隆入真核表達(dá)載體pCDNA3.1，并轉(zhuǎn)染入SH-SY5Y細(xì)胞，建立WDR26過表達(dá)細(xì)胞株，探討WDR26過表達(dá)對(duì)氧化應(yīng)激所致神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響；采用針對(duì)WDR26的反義寡核苷酸（antisense phosphorothioate o

6、ligodeoxynucleotides，asODNs）轉(zhuǎn)染，探討WDR26表達(dá)抑制對(duì)氧化應(yīng)激所致神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WDR26基因在H2O2所致氧化應(yīng)激中表達(dá)明顯增高；WDR26過表達(dá)可明顯抑制H2O2導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，提高SH-SY5Y細(xì)胞的存活率；相反，采用反義寡核苷酸技術(shù)使WDR26的表達(dá)降低則能夠顯著促進(jìn)H2O2導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞死亡。上述結(jié)果表明，WDR26對(duì)H2O2所致神經(jīng)細(xì)胞損傷具有明顯保

7、護(hù)作用。 AP-1是由Fos-Jun或Jun-Jun二聚體構(gòu)成的具有氧化還原敏感性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，對(duì)于內(nèi)源性和外源性ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激均具有重要調(diào)節(jié)作用。因此，本研究采用EMSA和熒光素酶報(bào)告基因檢測了WDR26過表達(dá)對(duì)H2O2所致神經(jīng)細(xì)胞中AP-1活化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WDR26過表達(dá)能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的AP-1的活化。因此，AP-1活化的抑制是WDR26發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)功能的可能機(jī)制之一。 星形膠質(zhì)細(xì)胞是一種最主

8、要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要作用。本研究采用U251-MG星形母細(xì)胞瘤細(xì)胞探討了WDR26對(duì)氧化應(yīng)激所致星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2能夠誘導(dǎo)U251-MG星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中WDR26表達(dá)顯著增加；WDR26過表達(dá)可明顯抑制H2O2導(dǎo)致的U251-MG細(xì)胞凋亡，提高U251-MG細(xì)胞的存活率；相反，采用反義寡核苷酸技術(shù)使WDR26的表達(dá)降低則能夠顯著促進(jìn)H2O2導(dǎo)致的U251-MG細(xì)胞死亡。這些研究結(jié)果強(qiáng)烈