晚期缺血預(yù)適應(yīng)對腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：腎臟晚期缺血預(yù)適應(yīng)大鼠模型的建立背景。 目的： 急性腎衰竭(ARF)是一種常見的臨床危重病癥，缺血/再灌注(I/R)損傷是導(dǎo)致ARF的重要因素。因此，尋找特異性干預(yù)手段來預(yù)防和治療急性缺血性腎衰竭是腎臟病學(xué)界亟待解決的重要問題。缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)有力預(yù)防缺血性器官損傷的內(nèi)源性措施，但其機(jī)制尚不清楚。IPC具有雙時相保護(hù)作用，分別稱為早期缺血預(yù)適應(yīng)和晚期缺血預(yù)適應(yīng)，后者又稱為延遲性IPC

2、，其保護(hù)作用在預(yù)缺血12-24小時后出現(xiàn)，持續(xù)幾天甚至數(shù)周。晚期IPC由于需要合成新的蛋白質(zhì)、保護(hù)作用更持久穩(wěn)定，易于研究和模仿等特點(diǎn)，與早期IPC相比更受到研究者的關(guān)注。但是，要深入研究一個現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制，必須要有一個好的實驗?zāi)Ｐ汀，F(xiàn)在國內(nèi)外尚未建立穩(wěn)定、高效的腎臟晚期缺血預(yù)適應(yīng)動物模型。本研究旨在通過比較不同預(yù)缺血方式的近期和遠(yuǎn)期保護(hù)效果，來構(gòu)建較理想的腎臟晚期IPC大鼠模型。 材料和方法：健康雄性Sprague-Dawle

3、y大鼠隨機(jī)分為7組： (1).假手術(shù)對照組(Sham/Sham)，只分離兩側(cè)腎蒂，不進(jìn)行夾閉： (2).缺血再灌注組(Sham/I)，沒有缺血預(yù)處理，用無損傷動脈夾夾閉兩側(cè)腎蒂40 min，然后恢復(fù)灌注； (3).10min缺血預(yù)處理組(I-10/I)，第0天夾閉兩側(cè)腎蒂10 min，造成預(yù)缺血，間隔一定時間后，再次缺血40 min； (4).15 min缺血預(yù)處理組(I-15/I)； (5).2

4、0 min缺血預(yù)處理組(1-20/I)； (6).25 min缺血預(yù)處理組(I-25/I)； (7).30 min 缺血預(yù)處理組(I-30/I)。預(yù)缺血和再次缺血的間隔時間分別設(shè)為1、2、4、8、16和28 d。第二次缺血后觀察時間分別為48 h、5周和10周。每組每個時間點(diǎn)n=6。采用酶法測定血清肌酐(Scr)濃度、尿素酶-GLDH法測定尿素氮(BUN)濃度來評價腎功能；HE、Masson及天狼猩紅染色觀察腎組織的病理

5、改變，采用Westemblot和免疫組織化學(xué)法檢測 5 周后纖維化相關(guān)因子(α-SMA、TGF-β1 和phosoho-Smad2) 在腎組織的表達(dá)和分布。最后綜合各組近期和遠(yuǎn)期的腎臟功能和組織形態(tài)學(xué)來判斷不同缺血預(yù)適應(yīng)方式的腎臟保護(hù)效果。 結(jié)論： 1).在一定范圍內(nèi)，缺血預(yù)處理的時間越長，對再次缺血的保護(hù)效果(對腎臟結(jié)構(gòu)、功能的保護(hù)強(qiáng)度和持續(xù)時間)越好，超過這個范圍后，既使再延長預(yù)缺血時間，保護(hù)效果也不會明顯增加，反而

6、會加重小管間質(zhì)纖維化； 2).肌成纖維細(xì)胞增多(α-SMA 陽性) 和 FGF-β1/Smad信號通路激活可能參與了缺血性腎間質(zhì)纖維化病理過程； 3).20 min缺血預(yù)處理具有顯著的近期和遠(yuǎn)期腎臟保護(hù)作用； 4). 適應(yīng)性預(yù)缺血和損傷性缺血之間要有一個合適的間隔時間。采用預(yù)缺血20 min-間隔 4 到8 d-再次缺血40 min的方法，可成功構(gòu)建穩(wěn)定、高效的腎臟晚期缺血預(yù)適應(yīng)大鼠模型。 第二部分：晚期

7、缺血預(yù)適應(yīng)對腎臟保護(hù)作用的機(jī)制研究背景。 目的： 腎臟固有細(xì)胞的命運(yùn)決定了腎臟疾病的兇險程度和預(yù)后。大量腎小管上皮細(xì)胞壞死是缺血性ARF的重要病理特征，炎癥反應(yīng)和微循環(huán)障礙在其中發(fā)揮了重要的作用。IPC能顯著減輕甚至逆轉(zhuǎn)缺血性ARF，但細(xì)胞和分子機(jī)制尚不清楚。在成功建立腎臟晚期缺血預(yù)適應(yīng)大鼠模型的基礎(chǔ)上，我們擬探討IPC對小管上皮細(xì)胞死亡及增殖修復(fù)、NF-κB相關(guān)炎癥反應(yīng)和血管活性物質(zhì)的影響。 材料和方法：SD大

8、鼠隨機(jī)分為3組： (1).假手術(shù)組(Sham)，只分離兩側(cè)腎蒂，不進(jìn)行夾閉； (2).單純?nèi)毖俟嘧⒔M(I/R)，第0天假手術(shù)，第4天用無損傷動脈夾夾閉兩側(cè)腎蒂40 min，然后恢復(fù)灌注； (3)缺血預(yù)適應(yīng)組(IPC)，第0天預(yù)缺血20 min，第4天再次缺血40 min。再灌注后4 h、24 h、48 h、72 h 處死大鼠(每個時間點(diǎn) n = 6)，收集血樣和腎臟標(biāo)本，進(jìn)行生化、病理及分子生物學(xué)分析。PAS

9、染色觀察腎組織形態(tài)學(xué)；透射電鏡觀察小管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡情況：Westem blot檢測IκB-α、eNOS 蛋白表達(dá)；免疫組織化學(xué)法觀察PCNA、ED-1、ICAM-1、TNF-α、p65、HIF-1α和HO-1 在腎組織的分布；熒光定量實時PCR檢測ICAM-1、TNF-α、eNOS、ET-1 和 HO-1 的mRNA表達(dá)；ELISA、放射免疫法分析血或腎組織巨噬細(xì)胞炎性蛋白-

10、2(MIP-2)、內(nèi)皮素-1(ET-1)和PGI2代謝產(chǎn)物(6-keto-PGF1α)含量；凝膠電泳遲滯分析(EMSA)檢測NF-κB/DNA 結(jié)合活性。 結(jié)論： 1).晚期缺血預(yù)適應(yīng)能夠減少小管上皮細(xì)胞壞死和凋亡，促進(jìn)其增殖修復(fù)； 2).IPC抑制了NF-κB相關(guān)的炎癥反應(yīng)； 3).IPC通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)血管舒縮物質(zhì)表達(dá)，改善了再灌注后微循環(huán)功能； 4).IPC通過誘導(dǎo)HIF-1α